Estudio de la degeneración y neuroprotección retiniana: taurina, terapia celular, reacción glial e inyecciones intravítreas de anticuerpos anti-VEGF

Abstract

Introducción: Las enfermedades degenerativas de los fotorreceptores de la retina comprenden un grupo heterogéneo de patologías retinianas causadas por factores ambientales y/o genéticos que conducen a la ceguera de forma irreversible. En esta Tesis Doctoral investigamos los efectos de diversas intervenciones experimentales sobre la retina de ratas normales o con degeneración hereditaria o inducida de los fotorreceptores. Objetivos: Estudiamos: I) en la retina de en ratas normales albinas los efectos adversos de las inyecciones intravítreas (IIV) de PBS, de ranibizumab y aflibercept y de un anti-VEGF de rata; II) en ratas albinas con degeneración fototóxica de la retina el papel de la glía en la degeneración de fotorreceptores; III) en la retina de la ratas normales albinas el efecto del déficit nutricional de taurina; IV) en ratas Royal College of Surgeons (RCS) el efecto de la suplementación de la dieta con taurina; V) en ratas RCS y P23H-1 el efecto de la terapia celular singénica (intravítrea o subretiniana) con células mononucleares derivadas de médula ósea (CMN-MO). Material y métodos: Se utilizaron ratas adultas Sprague-Dawley para los objetivos I, II y III, ratas RCS para el objetivo IV y ratas RCS y P23H-1 para el objetivo V. Para el objetivo III se indujo un déficit de taurina, mediante la administración de β-alanina al 3% en el agua y para los objetivos II y IV se indujo una degeneración fototóxica de la retina. Las retinas fueron procesadas como montajes globales o seccionadas transversalmente e inmunodetectadas para marcar los conos S y L/M, las células microgliales y macrogliales, las células ganglionares de la retina (CGR) y las CGR intrínsecamente fotosensibles (CGRif), las conexiones sinápticas y el estrés oxidativo celular. Resultados: I) Todas las IIV produjeron una activación de las células gliales, que fue mayor con las concentraciones más altas de ranibizumab y aflibercept, que provocaron también muerte de CGR, pero no de CGRif; II) La fototoxicidad produce anillos de degeneración de conos que muestran células microgliales activadas y células de Müller; III) La depleción de taurina produce degeneración de fotorreceptores, activación de células microgliales, estrés oxidativo, pérdida sináptica y alteración de la capacidad fagocítica del epitelio pigmentario de la retina (EPR) y estos efectos se agravan por la exposición a la luz; IV) La suplementación de la dieta de ratas RCS con taurina disminuye la activación microglial, la degeneración sináptica y el estrés oxidativo y aumenta la fagocitosis del EPR y mejora las respuestas electroretinográficas; V) Las inyecciones intravítreas o subretinianas de CMN-MO en ratas RCS y P23H-1 aumentan la supervivencia de los fotorreceptores, disminuyen la degeneración sináptica, pero no modifican la activación y migración de las células microgliales ni las respuestas electroretinográficas. Conclusiones: I) Las IIV de todas las sustancias tienen inflamatorios en la retina de la rata adulta que son mayores cuando se utilizan sustancias humanizadas y a dosis altas que producen inflamación severa y muerte de CGR, pero no de CGRif; II) Las de células microgliales y las células de anillos tienen acciones coordinadas que, en la fagocitosis de los fotorreceptores, la remodelación retiniana y la formación de sellos gliales. III) La depleción de taurina provoca en la retina de rata una muerte de fotorreceptores y CGR, alteración de la fagocitosis de las células del EPR y además aumenta la susceptibilidad de los fotorreceptores al daño fototóxico; IV) La suplementación de la dieta de ratas RCS con taurina disminuye la activación microglial, la degeneración de los fotorreceptores, el estrés oxidativo y mejora la funcionalidad de la retina; V) El trasplante intravítreo y subretiniano de CMN-MO singénicas disminuye la degeneración de los fotorreceptores pero no mejora la función retiniana.

Introduction: Degenerative diseases of retinal photoreceptors comprise a heterogeneous group of retinal pathologies caused by environmental and/or genetic factors that lead to irreversible blindness. In this Doctoral Thesis, we investigate the effects of various experimental interventions on the retina of normal rats or those with hereditary or induced photoreceptor degeneration. Objectives: We studied: I) in the retina of normal albino rats, the adverse effects of intravitreal injections (IVI) of PBS, ranibizumab, aflibercept, and a rat anti-VEGF; II) in albino rats with phototoxic retinal degeneration, the role of glia in photoreceptor degeneration; III) in the retina of normal albino rats, the effect of taurine nutritional deficiency; IV) in Royal College of Surgeons (RCS) rats, the effect of taurine dietary supplementation; V) in RCS and P23H-1 rats, the effect of syngeneic cell therapy (intravitreal or subretinal) with bone marrow-derived mononuclear cells (BM-MNC). Methods: Adult Sprague-Dawley rats were used for objectives I, II, and III; RCS rats for objective IV; and RCS and P23H-1 rats for objective V. For objective III, taurine deficiency was induced by administering 3% β-alanine in the water, and for objectives II and IV, phototoxic retinal degeneration was induced. Retinas were processed as whole mounts or cross-sectioned and immunodetected to label S and L/M cones, microglial and macroglial cells, retinal ganglion cells (RGCs), intrinsically photosensitive RGCs (ipRGCs), synaptic connections, and cellular oxidative stress. Results: I) All IVIs triggered glial cell activation, which was greater with higher concentrations of ranibizumab and aflibercept, also causing RGC death but not ipRGC death; II) Phototoxicity produces rings of cone degeneration showing activated microglial and Müller cells; III) Taurine depletion induces photoreceptor degeneration, microglial activation, oxidative stress, synaptic loss, and impaired phagocytic capacity of the retinal pigment epithelium (RPE), and these effects are exacerbated by light exposure; IV) Taurine supplementation in the diet of RCS rats decreases microglial activation, synaptic degeneration, and oxidative stress, increases RPE phagocytosis, and improves electroretinographic responses; V) Intravitreal or subretinal injections of BM-MNCs in RCS and P23H-1 rats increase photoreceptor survival and reduce synaptic degeneration but do not alter microglial cell activation or migration, nor do they improve electroretinographic responses. Conclusions: I) IVIs of all substances have inflammatory effects on the retina of adult rats, which are more pronounced when humanized substances are used at high doses, causing severe inflammation and RGC death but not ipRGC death; II) Microglial cells and Müller cells have coordinated actions in photoreceptor phagocytosis, retinal remodeling, and the formation of glial seals; III) Taurine depletion in the rat retina induces photoreceptor and RGC death, impaired phagocytosis by RPE cells, and increased susceptibility of photoreceptors to phototoxic damage; IV) Taurine supplementation in the diet of RCS rats decreases microglial activation, photoreceptor degeneration, oxidative stress, and improves retinal function; V) Intravitreal and subretinal transplantation of syngeneic BM-MNCs reduces photoreceptor degeneration but does not improve retinal function.