Optimization of vitrification protocols for embryos and oocytes in the porcine species

Abstract

Objetivos: el objetivo principal de esta Tesis fue optimizar el protocolo de vitrificación de embriones porcinos mediante la modificación del sistema Cryotop (Cryotopm) para la vitrificación simultánea de un elevado número de embriones y ovocitos, y analizar su impacto en el transcriptoma embrionario. Para este fin, los objetivos específicos contenidos en esta Tesis fueron: 1) evaluar el sistema Cryotopm en su forma abierta y cerrada para la vitrificación de mórulas y blastocistos producidos in vivo, y su calidad tras el calentamiento; 2) investigar los efectos de la vitrificación simultánea de un elevado número de blastocistos sobre la expresión génica y el transcriptoma de microARNs (miARNs); 3) evaluar la viabilidad de blastocistos producidos in vitro tras la vitrificación con el sistema Cryotopm; 4) estudiar el impacto del tiempo de equilibrado con crioprotectores y la suplementación con melatonina en el medio de maduración in vitro en la viabilidad y calidad de los ovocitos vitrificados y calentados con el sistema Cryotopm. Metodología: En la metodología general incluida en esta Tesis se describen los procesos de obtención de embriones in vivo y de producción de embriones in vitro, la vitrificación y el calentamiento (V-C) de embriones y ovocitos y la evaluación de la viabilidad tras la V-C. La metodología específica del Artículo 1 describe técnicas de evaluación de la calidad de los embriones V-C. En la metodología de los Artículos 2 y 3 se describen los procesos de extracción de ARN de los blastocistos y preparación de las muestras para los estudios de expresión génica y de transcriptoma de miARNs, respectivamente. La metodología del Artículo 4 incluye la evaluación de la calidad de los embriones producidos in vitro tras la V-C. Por último, la metodología específica del Artículo 5 describe las técnicas empleadas para la evaluación de la viabilidad y la calidad de los ovocitos tras la V-C. En cada artículo se incluyen además los análisis estadísticos realizados, así como un breve diseño experimental. Conclusiones: Las principales conclusiones de esta Tesis Doctoral son: 1) El sistema Cryotopm abierto (CA) permite la vitrificación de 20 embriones porcinos obtenidos in vivo en los estadios de mórula, blastocisto temprano y blastocisto, proporcionando unos parámetros de viabilidad y calidad post-calentamiento similares a la de los embriones frescos; 2) La vitrificación con los sistemas CA y SOPS tiene un efecto moderado sobre la expresión génica de los blastocistos porcinos. En embriones vitrificados con el sistema CA, se modifica la expresión de más genes relacionados con la proliferación celular y se alteran menos genes relacionados con la apoptosis;3) La vitrificación con los sistemas CA y SOPS modifica la expresión de miARNs en los blastocistos porcinos, habiendo mínimas diferencias entre ambos sistemas, alterando la expresión de miARNs relacionados con la proliferación celular, la apoptosis y la respuesta celular al estrés; 4) La vitrificación simultánea de 20 blastocistos porcinos producidos in vitro con el sistema CA proporciona mejores resultados de viabilidad y parámetros de apoptosis que la vitrificación empleando el sistema SOPS; 5) La viabilidad de los ovocitos maduros de cerdo vitrificados con el sistema CA aumenta con el incremento del tiempo de equilibrado con los crioprotectores, alcanzando su máximo a los 60 minutos y presentando estos ovocitos una morfología de la placa metafásica similar a la de los ovocitos sin vitrificar; 6) La suplementación con 10-9 M de melatonina en el medio de maduración no tiene efecto en la viabilidad ni la morfología de la placa metafásica de los ovocitos maduros de cerdo vitrificados con el sistema CA.

Objectives: The main objective of this Thesis was to optimize the vitrification protocol for porcine embryos by modifying the Cryotop (Cryotopm) system for the simultaneous vitrification of a large number of embryos and oocytes, and to analyze its impact on the embryonic transcriptome. To achieve this, the specific objectives outlined in this Thesis were: 1) to evaluate the Cryotopm system in both its open and closed forms for the vitrification of in vivo produced morulae and blastocysts, and their quality after warming; 2) to investigate the effects of simultaneous vitrification of a large number of blastocysts on gene expression and the microRNA (miRNA) transcriptome; 3) to assess the viability of in vitro produced blastocysts after vitrification using the Cryotopm system; 4) to study the impact of the equilibration time with cryoprotectants and melatonin supplementation in the in vitro maturation medium on the viability and quality of vitrified and warmed (V-W) oocytes using the Cryotopm system. Methodology: The general methodology included in this Thesis describes the processes for obtaining in vivo embryos and producing in vitro embryos, as well as the vitrification and warming of embryos and oocytes and the evaluation of their viability after V-W. The specific methodology for each article is also described: specific methodology for Article 1 describes techniques for assessing the quality of V-C embryos. Specific methodology of Articles 2 and 3, outlines the processes for RNA extraction from blastocysts and sample preparation for gene expression and miRNA transcriptome studies, respectively. Article 4 includes the evaluation of the quality of in vitro produced embryos after V-C. Finally, the specific methodology in Article 5 details the techniques used for the evaluation of the viability and quality of oocytes after V-W. The specific methodology of each article also includes the statistical analyses performed, along with a brief experimental design. Conclusions: The main conclusions of this Doctoral Thesis are: 1) The open Cryotopm system (CA) allows for the vitrification of 20 in vivo porcine embryos at the morula, early blastocyst, and blastocyst stages, providing post-warming viability and quality parameters similar to those of fresh embryos; 2) Vitrification with the OC and SOPS systems has a moderate effect on the gene expression of porcine blastocysts. In embryos vitrified using the OC system, more genes related to cell proliferation are affected, while fewer genes associated with apoptosis are altered; 3) Vitrification with both the OC and SOPS systems modifies the expression of miRNAs in porcine blastocysts, with minimal differences between the two systems, altering the expression of miRNAs related to cell proliferation, apoptosis, and the cellular stress response; 4) The simultaneous vitrification of 20 in vitro produced porcine blastocysts using the OC system yields better viability results and apoptosis parameters compared to vitrification using the SOPS system; 5) The viability of mature porcine oocytes vitrified with the OC system increases with longer equilibration times with cryoprotectants, reaching its maximum at 60 minutes, and these oocytes exhibit a morphology of the metaphase plate similar to that of non-vitrified oocytes; 6) Supplementation with 10-9 M of melatonin in the in vitro maturation medium has no effect on the viability or metaphase plate morphology of mature porcine oocytes vitrified with the OC system