Impact of the inflammasome on hematopoiesis and pyroptosis : pharmacological target discovery and drug validation for the treatment of anemia

Abstract

Las enfermedades crónicas y los trastornos hematopoyéticos están estrechamente vinculados a la disfunción del inflamasoma. En esta tesis doctoral, se utilizaron modelos de pez cebra para investigar cómo la inflamación, y en particular el inflamasoma y la muerte celular por piroptosis, influyen en la hematopoyesis. En el primer capítulo, la inhibición genética del inflamasoma en macrófagos aumentó el número de estas células en larvas de pez cebra con inflamación cutánea, sin afectar los recuentos de eritrocitos o neutrófilos. De manera similar, la inhibición del inflamasoma en neutrófilos incrementó su número bajo condiciones inflamatorias sin alterar otros tipos celulares. Por otro lado, la hiperactivación del inflamasoma en neutrófilos promovió su muerte, pero esta fue mitigada por la inhibición farmacológica de Gasdermina E (Gsdme). Esto subraya el papel del inflamasoma mieloide en la piroptosis, mediada por Gsdme, en el pez cebra. En el segundo capítulo, dilucidamos el mecanismo de activación del inflamasoma NLRP1 en las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs). La diferenciación eritroide de las HSPCs activó el eje de la quinasa ZAKα/P38, lo que promovió la fosforilación, ensamblaje y activación de NLRP1. La inhibición de ZAKα con el fármaco Nilotinib, aprobado por la FDA/EMA, alivió la neutrofilia en un modelo de pez cebra con inflamación neutrofílica y promovió la diferenciación eritroide y la acumulación de GATA1 en células humanas K562. Estos sugiere nuevas vías terapéuticas para tratar trastornos hematopoyéticos asociados con inflamación crónica. En el tercer capítulo, se exploró el potencial terapéutico de los inhibidores de ZAKα, específicamente los inhibidores de tirosina quinasa (TKI) aprobados por la FDA/EMA, para tratar la anemia de Diamond-Blackfan (DBA). Nilotinib promovió la diferenciación eritroide en células K562 al aumentar la acumulación de GATA1 y al inhibir el eje ZAKα/P38/NLRP1/CASP1. Estos efectos se confirmaron en HSPCs humanas CD34+ y en modelos de pez cebra, donde Nilotinib y otros TKI aumentaron la eritropoyesis a expensas de la mielopoyesis y redujeron la actividad de caspasa-1. Además, los TKI también mejoraron la diferenciación eritroide defectuosa en un modelo humano de DBA con edición de RPS19 y en HSPCs de pacientes con DBA. Por lo tanto, la reutilización de los TKI presenta una prometedora estrategia terapéutica para la DBA y posiblemente otras anemias congénitas y trastornos de la línea mieloide. En el cuarto capítulo, investigamos el papel no canónico de Ninjurin-1 (Ninj1) en la formación de HSPCs en larvas de pez cebra. Las larvas deficientes en Ninj1 mostraron una reducción de neutrófilos, eritrocitos y HSPCs, junto con una disminución en la actividad de caspasa-1, lo que sugiere un papel más amplio que su función conocida en la ruptura de la membrana plasmática. La deficiencia de Ninj1 alivió la neutrofilia y la inflamación cutánea. Se identificaron residuos conservados críticos para la actividad de ruptura de la membrana plasmática de Ninj1 en pez cebra mediante análisis mutante. Además, la deficiencia de Ninj1 afectó la respuesta a infecciones bacterianas, reduciendo el reclutamiento de células inmunitarias y la supervivencia, mientras que la sobreexpresión de Ninj1A56P, sin actividad de ruptura de membrana, aumentó la susceptibilidad larval y el reclutamiento de células mieloides. Importante, encontramos que Ninj1 y Ninj2 regulaban de manera redundante la hematopoyesis a través de la señalización Wnt. La deficiencia combinada de ambos ninjurins redujo drásticamente todas las líneas celulares sanguíneas, subrayando su papel esencial en la aparición de HSPCs desde el endotelio hemogénico. Los análisis de expresión génica, reporteros Wnt y experimentos genéticos confirmaron la participación de los ninjurins en el desarrollo de HSPCs. Nuestros estudios avanzan en la comprensión del inflamasoma y otras vías moleculares en la hematopoyesis y la inflamación, revelando posibles estrategias terapéuticas para tratar trastornos hematopoyéticos.

Chronic diseases and hematopoietic disorders are closely linked to inflammasome dysregulation. In the present PhD thesis, we have used the zebrafish models to elucidate the impact of inflammation, and in particular of the inflammasome and pyroptotic cell death, in hematopoiesis. In the first chapter, we demonstrated that genetic inhibition of the macrophage inflammasome increased macrophage numbers in zebrafish larvae with skin inflammation without affecting erythrocyte or neutrophil counts. Similarly, inhibiting the neutrophil inflammasome resulted in increased neutrophil numbers under inflammatory conditions, without impacting other cell types. Conversely, hyperactivation of the neutrophil inflammasome promoted neutrophil death, which was mitigated by pharmacological inhibition of Gasdermin E (Gsdme), highlighting the myeloid inflammasome's role in pyroptotic cell death via a Gsdme-dependent pathway in zebrafish. In the second chapter, we dilucidated the mechanism of activation of the NLRP1 inflammasome in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Erythroid differentiation of HSPCs activated the ZAKα/P38 kinase axis, promoting NLRP1 phosphorylation, assembly and activation. Inhibition of ZAKα with the FDA/EMA-approved drug Nilotinib alleviated neutrophilia in a zebrafish model of neutrophilic inflammation and promoted erythroid differentiation and GATA1 accumulation in human K562 cells. These findings suggest novel therapeutic avenues for treating hematopoietic disorders associated with chronic inflammation. In the third chapter, the therapeutic potential of ZAKα inhibitors, specifically FDA/EMA- approved tyrosine kinase inhibitors (TKIs), was explored for treating Diamond-Blackfan anemia (DBA). It as found that nilotinib promoted erythroid differentiation in K562 cells by enhancing GATA1 accumulation and inhibiting the ZAKα/P38/NLRP1/CASP1 axis. These effects were confirmed in human CD34+ HSPCs and zebrafish models, where Nilotinib and other TKIs increased erythropoiesis at the expense of myelopoiesis and reduced caspase-1 activity. Furthermore, TKIs also alleviated defective erythroid differentiation in a human RPS19-edited model of DBA and HSPCs from DBA patients. Therefore, the repurposing of TKIs presents a promising therapeutic strategy for DBA and potentially other congenital anemias and myeloid lineage disorders. In the fourth chapter, the non-canonical role of Ninjurin-1 (Ninj1) in HSPC formation was investigated in zebrafish larvae. Ninj1-deficient larvae exhibited reduced neutrophils, erythrocytes, and HSPCs, along with decreased caspase-1 activity, suggesting a broader role beyond its known function in plasma membrane rupture. Ninj1 deficiency alleviated neutrophilia and skin inflammation. Conserved residues critical for zebrafish Ninj1 plasma membrane rupture (PMR) activity were identified through mutant analysis. Ninj1 deficiency also impacted the response to bacterial infection, reducing immune cell recruitment and survival, while overexpression of Ninj1A56P, which is devoid of PMR activity, increased larval susceptibility and myeloid cell recruitment. Importantly, we found that Ninj1 and Ninj2 redundantly regulated hematopoiesis via Wnt signaling. Combined deficiency of both ninjurins drastically reduced all blood cell lineages, underscoring their essential role in HSPC emergence from the hemogenic endothelium. Gene expression, Wnt reporter analysis and genetic experiments confirmed Ninjurins' involvement in HSPC development. These findings highlight Ninjurins as key regulators of HSPC emergence, with potential applications in enhancing HSPC production for regenerative medicine. Our studies collectively advance our understanding of the inflammasome and other molecular pathways in hematopoiesis and inflammation, revealing potential therapeutic strategies for treating hematopoietic disorders.