Application of antimicrobial peptides for the control of betanodavirus in European sea bass

Abstract

Esta Tesis Doctoral se centra en la caracterización de péptidos antimicrobianos (AMPs) de peces teleósteos y su implicación en la respuesta inmunitaria. Concretamente, nos planteamos evaluar la capacidad inmunomoduladora de los AMPs NK-lisina (Nkl), hepcidina (Hamp) y dicentracina (Dic) de lubina y su aplicación como agentes antivirales frente a nodavirus (NNV) en lubina. La primera fase de la experimentación fue comprobar la capacidad inmunomoduladora in vitro de dichos AMPs sintéticos, derivados de lubina, en leucocitos de riñón cefálico de dorada y lubina. Se estudió la capacidad fagocítica por citometría de flujo y el estallido respiratorio por quimioluminiscencia, sin detectar regulación por dichos AMPs. En cambio, se observó, mediante qPCR, el aumento significativo de la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune antiviral en lubina y su descenso generalizado en dorada. Estos datos apuntaron a la idoneidad de los AMPs sintéticos derivados de lubina para su uso en lubina, pero no en dorada, indicando una especificidad de especie. Tras esto, se estudió la posible función y aplicación de estos AMPs en lubina mediante estudios in vivo. Al administrarlos en forma de plásmidos de expresión, estos se transcribieron en el músculo y aumentaron los niveles de dichasproteínas y la capacidad microbicida. Además, indujeron la expresión de marcadores proinflamatorios, aunque no consiguieron mejorar la supervivencia frente a infecciones con NNV. El siguiente paso fue testar los AMPs sintéticos Hamp y Dic in vivo en lubina ya que Nkl había sido previamente evaluada con resultados excelentes. Se comenzó analizando su potencial como inmunomoduladores, demostrándose una reducción en la expresión de marcadores proinflamatorios y un aumento de marcadores leucocitarios como neutrófilos, macrófagos y linfocitos B. Estas alteraciones se relacionan con una ventaja para el hospedador al luchar contra infecciones virales, por lo que se valoró su potencial como agente preventivo frente a NNV. Los resultados fueron muy satisfactorios mejorando en ambos casos la supervivencia frente al virus en un 30%. Este aumento de la supervivencia podría ser debido a la inducción de un estado antiinflamatorio en el tejido diana del virus, el cerebro, y la sobreexpresión del complejo Cxcr3/Cxcl9, que facilita la infiltración de células clave para la resolución viral como linfocitos T, neutrófilos o macrófagos. Curiosamente, la administración terapéutica de estos AMPs sintéticos tras la infección con NNV mostraron también una mejoría en la supervivencia de las lubinas tratadas con Hamp y Dic, y una inmunomodulación similar al tratamiento previo. Sin embargo, los niveles de virus no se vieron afectados, por lo que el efecto lítico directo de los AMPs sobre las partículas virales parece no ser relevante. Por el contrario, la administración de Nkl sintética solo logró retrasar la aparición de las mortalidades, pero no evitarlas, y únicamente estimuló la respuesta citotóxica, siendo esta claramente insuficiente para evitar la mortalidad por NNV. En conclusión, los péptidos sintéticos Hamp y Dic pueden ser considerados como excelentes herramientas para el control de NNV en granjas de lubina gracias a sus funciones inmunomoduladoras, tanto administrado de forma profiláctica como terapéutica.

This Doctoral Thesis focuses on the characterization of antimicrobial peptides (AMPs) from teleost fish and their involvement in the immune response. Specifically, we aimed to evaluate the immunomodulatory capacity of the European sea bass AMPs NK-lysin (Nkl), hepcidin (Hamp) and dicentracin (Dic) and their application as antiviral agents against nodavirus (NNV) in sea bass. Firstly, we wanted to verify the in vitro immunomodulatory capacity of these synthetic AMPs, derived from sea bass, in head-kidney leukocytes from gilthead seabream and sea bass. The phagocytic capacity and respiratory burst activity were not affected by incubation with the AMPs at functional level. However, a significant increase in the expression of genes related to the antiviral immune response in sea bass was observed by qPCR while the opposite occurred in seabream leucocytes. These data pointed to the suitability of sea bass-derived synthetic AMPs for use in sea bass, but not seabream, indicating species-specificity. After this, the possible function and application of these AMPs in sea bass was studied through in vivo experiments. When administered in the form of expression plasmids, these AMPs were transcribed in the muscle and increased the levels of these proteins and the microbicidal capacity. Furthermore, they induced the expression of proinflammatory markers, although they failed to improve the survival against NNV infections. The next step was to test the synthetic AMPs Hamp and Dic in vivo in sea bass since Nkl had previously been evaluated with excellent results. First, we found important immunostimulatory properties since a reduction in the expression of pro-inflammatory markers and an increase in leukocyte markers such as neutrophils, macrophages and B lymphocytes was evidenced. These alterations are related to an advantage for the host when fighting viral infections, so their potential as preventive agents against NNV was assessed. The results were very satisfactory, improving survival rates against the virus around 30% in both cases. This increase in survival could be due to the induction of an anti-inflammatory state in the target tissue of the virus, the brain, and the overexpression of the Cxcr3/Cxcl9 complex, which facilitates the infiltration of key cells for viral resolution such as T lymphocytes, neutrophils or macrophages. Interestingly, the therapeutic administration of these synthetic AMPs after infection with NNV also showed an improvement in the survival of sea bass treated with Hamp and Dic, and an immunomodulation similar to the preventive treatment. However, virus levels were not affected, so the direct lytic effect of AMPs on viral particles seems not to be relevant. On the contrary, the administration of synthetic Nkl only managed to delay the onset of mortalities, but not prevent them, and only stimulated the cytotoxic response, which was clearly insufficient to reduce the mortalities associated to NNV. In conclusion, the synthetic peptides Hamp and Dic could be considered excellent tools for the control of NNV in European sea bass farms thanks to their immunomodulatory functions, both administered prophylactically and therapeutically.