Técnicas analíticas para la caracterización químico-farmacéutica de lacas para el tratamiento de la onicomicosis

Abstract

Las infecciones fúngicas de las manos y los pies son muy comunes en los seres humanos. Los dermatofitos, las levaduras y los mohos son los tres principales hongos que afectan a la piel, pueden causar onicomicosis y perjudican a la población mundial. En la actualidad, en el mercado internacional existen muchos agentes antimicóticos orales que se han utilizado para el tratamiento de infecciones fúngicas de las uñas de las manos y de los pies, pero estos muestran varias desventajas como toxicidad y altos contenidos en el ingrediente farmacéutico activo (IFA). El IFA 2-bromo-5-(2-bromo-2-nitrovinil)furano (también conocido como Furvina®) es un agente antimicrobiano eficiente con actividad de amplio espectro contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, levaduras y hongos filamentosos. El fármaco Dermofural® es un ungüento dermatológico sobre la base de este IFA al 0,15% para el tratamiento de enfermedades fungosas en piel y uñas, que forma parte del Cuadro Básico de Medicamentos de Cuba. Este fármaco es activo frente a la onicomicosis, pero requiere tratamientos prolongados debido a su poca penetración en la uña, ya que es un ungüento. .En esta Tesis se pretende como objetivo general el desarrollo de diferentes metodologías analíticas para la caracterización químico-farmacéutica de lacas de uñas para el tratamiento de la onicomicosis conteniendo como Furvina® como IFA. Se ha propuesto el desarrollo y validación de una técnica analítica espectrofotométrica UV/VIS para la determinación de Furvina® en diferentes lacas. La validación del método mediante guías internacionales mostró excelentes resultados de especificidad, linealidad, precisión (coeficientes de variación (CV) inferiores a 5%), veracidad (97-103%) y sensibilidad (límite de detección (LD) y de cuantificación (LQ) igual a 0,038 y 0,156 µg/mL, respectivamente). Así, la metodología propuesta resulta una interesante herramienta de muy fácil acceso para la mayoría de los laboratorios para la determinación de Furvina®. Se desarrolla y valida un método basado en la combinación de cromatografía líquida capilar con detección de diodos en serie (LCcapilar-DAD) para la determinación de Furvina® en lacas. La validación del método proporcionó valores muy favorables para linealidad (0,1-10 µg/mL), precisión (CV< 5%), veracidad (99-101%) y sensibilidad (0,01 y 0,035 µg/mL para LD y LQ, respectivamente). Por otro lado, la aplicación de la técnica miniaturizada microextracción dispersiva líquido-líquido (DLLME) en el tratamiento de las muestras de orina de forma previa a su análisis mediante LCcapilar-DAD ha permitido no solo incrementar la sensibilidad de la metodología, sino que simultáneamente mejora la selectividad, al actuar DLLME preconcentrando el analito y limpiando la matriz de la muestra. Así, el método DLLME con LCcapilar-DAD desarrollado permite alcanzar altos niveles de preconcentración del analito en tiempos muy reducidos con excelentes valores para los distintos parámetros analíticos. Se propone la caracterización de las lacas de uñas mediante diferentes metodologías analíticas incluyendo difracción de rayos X (XRD), microscopía electrónica de barrido (SEM), espectroscopía infrarroja (IR) y calorimetría diferencial de barrido (DSC), mostrándose como herramientas de gran utilidad. Así, los difractogramas obtenidos mediante XRD sugieren que las lacas no cumplen la Ley de Bragg, no siendo atravesadas por los rayos X. Los análisis SEM han mostrado cambios morfológicos y tipográficos de los cristales del IFA en los formulados. La detección de las bandas características del IFA mediante análisis IR de los formulados corroboran la presencia de la Furvina® en las lacas. Asimismo, los resultados obtenidos mediante DSC han permitido establecer las condiciones óptimas de temperatura de almacenamiento de los formulados (87,57-95,46 ºC). Además, la evaluación de la penetrabilidad de las lacas utilizando celdas de Franz concluye la necesidad de recomendar tiempos de contacto con la uña superiores a 11 días para que sean efectivas. Se aborda también el uso de la técnica espectrofotometría de absorción atómica con atomización electrotérmica con fuente continua de alta resolución para la determinación de los niveles de los metales plomo, arsénico y cobre en diferentes lacas de uñas y en el IFA Furvina®. Las metodologías desarrolladas para los metales han permitido alcanzar muy buenos resultados para los parámetros de validación, confirmando que cumplen con los límites máximos establecidos por las normas internacionales, por lo que los productos pueden considerarse seguros en cuanto a los metales estudiados. Por último, se estudia la toxicidad a dosis única dérmica en conejos y se determinan los efectos irritantes y/o corrosivos dérmicos en conejos para las lacas de uñas. Los resultados obtenidos permiten afirmar que las lacas no producen toxicidad dérmica demostrable al administrarse a una dosis límite de 2000 mg/kg; además, no presentan potencial irritante dérmico y se clasifican como no irritantes para la piel.

Fungal infections of the hands and feet are very common in humans. Dermatophytes, yeasts and moulds are the three main fungi that affect the skin and can cause onychomycosis. Currently, there are many commercially available oral antifungal agents that have been used for the treatment of fungal infections of the fingernails and toenails, but these show several disadvantages such as toxicity and high active pharmaceutical ingredient (API) contents. The API 2-bromo-5-(2-bromo-2-nitrovinyl)furan (also known as Furvina®) is an efficient antimicrobial agent with broad spectrum activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria, yeasts and filamentous fungi. The drug in the form of a dermatological ointment based on this 0.15% IFA for the treatment of fungal diseases of skin and nails is active against onychomycosis but requires prolonged treatments due to its poor penetration into the nail, as it is an ointment. The general objective of this Thesis is to develop different analytical methodologies for the chemical-pharmaceutical characterisation of nail lacquers for the treatment of onychomycosis containing Furvina® as an IFA. The development and validation of a UV/VIS spectrophotometric analytical technique for the determination of Furvina® in different lacquers has been proposed. The validation of the method using international guidelines showed excellent results of specificity, linearity, precision (coefficients of variation (CV) lower than 5%), trueness (97-103%) and sensitivity (limit of detection (LOD) and limit of quantification (LQ) equal to 0.038 and 0.156 µg/mL, respectively). Thus, the proposed methodology is an interesting tool easily accessible to most laboratories for the determination of Furvina®. A method based on the combination of capillary liquid chromatography with diode array detection (LCcapillary-DAD) is developed and validated for the determination of Furvina® in lacquers. Method validation provided very favourable values for linearity (0.1-10 µg/mL), precision (CV< 5%), trueness (99-101%) and sensitivity (0.01 and 0.035 µg/mL for LD and LQ, respectively). On the other hand, the application of the miniaturised dispersive liquid-liquid microextraction technique (DLLME) in the treatment of urine samples prior to their analysis by LCcapillary-DAD has allowed not only to increase the sensitivity of the methodology, but also to simultaneously improve selectivity, as DLLME acts by pre-concentrating the analyte and cleaning the sample matrix. Thus, the DLLME with LCcapillary-DAD developed method allows reaching high levels of analyte preconcentration in very short times with excellent values for the different analytical parameters. The characterisation of nail lacquers is proposed using different analytical methodologies including X-ray diffraction (XRD), scanning electron microscopy (SEM), infrared spectroscopy (IR) and differential scanning calorimetry (DSC), which are shown to be very useful tools. Thus, diffractograms obtained by XRD suggest that the lacquers do not comply with Bragg's Law, as they are not penetrated by X-rays. SEM analyses have shown morphological and typographical changes of the IFA crystals in the formulations. The detection of the characteristic IFA bands by IR analysis of the formulations corroborates the presence of Furvina® in the lacquers. Likewise, the results obtained by DSC have allowed establishing the optimum storage temperature conditions of the formulations (87.57-95.46 ºC). In addition, the evaluation of the penetrability of the lacquers using Franz cells concludes the need to recommend contact times with the nail longer than 11 days for them to be effective. The use of the atomic absorption spectrophotometry technique with high resolution continuous source electrothermal atomisation for the determination of the levels of the metals lead, arsenic and copper in different nail lacquers and in Furvina® IFA is also addressed. The methodologies developed for the metals have allowed very good results to be achieved for the validation parameters, confirming that they comply with the maximum limits established by international standards, so that the products can be considered safe in terms of the metals studied. Finally, the dermal single dose toxicity in rabbits is studied and the dermal irritant and/or corrosive effects on rabbits are determined for the nail lacquers. The results obtained show that the lacquers do not produce demonstrable dermal toxicity when administered at a limit dose of 2000 mg/kg; furthermore, they have no dermal irritant potential and are classified as non-irritating to the skin.