Neutrophils and macrophages contribution to the hyperinflammation induced by SARS-CoV-2 spike protein and Salmonella Typhimurium infection in zebrafish

Abstract

Esta tesis doctoral estudia el papel de los neutrófilos y macrófagos en la inflamación inducida por la proteína Spike (S) del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2) y la infección por Salmonella enterica serovar Typhimurium (ST), utilizando el pez cebra como modelo, con un enfoque en la actividad del inflamasoma. El SARS-CoV-2 causa neumonía viral en humanos, conocida como enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). La proteína S del virus se une al receptor ACE2 en las células epiteliales humanas, lo que conduce a una disminución de ACE2, provocando vasoconstricción, estrés oxidativo e inflamación. Además, la proteína S contribuye al síndrome de liberación de citoquinas (CRS) asociado a COVID-19 y activa el inflamasoma NLRP3, una plataforma molecular involucrada en la eliminación de infecciones intracelulares y en la respuesta a daños estériles. Con respecto a ST, esta bacteria intracelular es un patógeno relevante que causa enfermedades transmitidas por alimentos y es un modelo excelente para estudiar las respuestas del huésped a bacterias intracelulares. Los neutrófilos y macrófagos, como primeros en responder a la infección, interactúan para regular la inflamación. Los neutrófilos suelen llegar primero y desencadenar que los macrófagos adopten un fenotipo proinflamatorio (M1), aunque los macrófagos antiinflamatorios (M2) persisten y strán implicados en la resolución de la inflamación. Aunque la interacción entre estos dos tipos de células es ampliamente reconocida, el papel desempeñado por sus inflamasomas en estas interacciones no lo es. Esta tesis doctoral utilizó la inyección de larvas de pez cebra con el dominio S1WT de la proteína S del COVID-19 para inducir inflamación, revelando un aumento de macrófagos M1 sin cambios significativos en los neutrófilos. La eliminación de neutrófilos redujo la inflamación y la monocitosis, mientras que la eliminación de macrófagos tuvo el efecto opuesto, destacando sus diferentes funciones. Experimentos adicionales mostraron que la inhibición del inflamasoma en neutrófilos atenuó la inflamación y la neutrofilia en modelos de pez cebra asociados con CRS por COVID-19 e infección por ST, mientras que la inhibición del inflamasoma en macrófagos aumentó la inflamación y la monocitosis en ambos modelos. Estos resultados demuestran que el inflamasoma de neutrófilos es proinflamatorio, mientras que el inflamasoma de macrófagos desempeña un papel antiinflamatorio no apreciado previamente, al menos en los modelos de CRS asociado a COVID-19 e infección por ST. Además, la sobreactivación del inflamasoma en neutrófilos aumentó la resistencia bacteriana y redujo la inflamación, y produjo monocitosis y neutropenia debido a la muerte de neutrófilos mediante piroptosis mediada por gasdermina E (Gsdme). Esta sobreactivación también resultó en un aumento en el número de macrófagos, que, inesperadamente, eran más resistentes a la eliminación por la bacteria. En contraste, la inhibición del inflamasoma de macrófagos mediante la expresión específica de DN Asc no protegió a estas células de la eliminación bacteriana. Sin embargo, la sobreactivación del inflamasoma de macrófagos disminuyó la resistencia bacteriana y exacerbó la inflamación y el reclutamiento de neutrófilos, y produjo neutrofilia y monocitopenia en el modelo de infección por ST. Se generó una nueva línea transgénica, Tg(lyz:Dendra-Asc), para visualizar la proteína ASC in vivo. Los neutrófilos que expresaban Dendra-Asc mostraron dos fenotipos diferentes: distribución uniforme de ASC dentro de la célula y células con aglomerado de ASC ya formado, lo que indica que la sobreactivación de ASC por sí sola puede iniciar la formación de ASC y la activación del inflamasoma sin estímulos adicionales. Un hallazgo significativo fue la transferencia de ASC de neutrófilos a macrófagos, indicando un interacción directa entre estas células. Además, la inflamación impulsada por la proteína S aumentó el número de neutrófilos activados con un aglomerado ASC, y promovió su liberación y transferencia a neutrófilos y macrófagos circundantes. También se examinó el papel de Gsdme, la molécula efectora clave en la piroptosis. La deficiencia de Gsdme y la administración de glicina, que inhibe la rotura de la membrana plasmática, rescataron la muerte de neutrófilos causada por la sobreactivación del inflamasoma, pero inesperadamente redujeron la monocitosis, revelando la compleja interacción entre estas células y las propiedades antiinflamatorias dependientes de Gsdme del inflamasoma de macrófagos. Para explorar más a fondo la interacción entre neutrófilos y macrófagos, se utilizó el modelo de CRS asociado con COVID-19 para investigar el papel de la quimiocina Cxcl8 y sus receptores Cxcr1 y Cxcr2. Los neutrófilos fueron los primeros en llegar al sitio de inflamación, guiados por Cxcl8, que se unió a los receptores Cxcr1 y Cxcr2. Estos hallazgos sugieren que el rápido reclutamiento de neutrófilos hacia la proteína S fue esencial para montar una respuesta inflamatoria adecuada y para el reclutamiento y activación subsecuente de macrófagos. Además, la inhibición farmacológica de Cxcr2 afectó mínimamente la inflamación local, pero redujo significativamente la inflamación sistémica y la mielopoyesis de emergencia. La disminución de Cxcr2 mediada por CRISPR/Cas9 confirmó su papel en el reclutamiento de células inmunitarias y la inflamación. Además, Cxcr1 también desempeñó un papel en la interacción entre neutrófilos y macrófagos, ya que la deficiencia de Cxcr1 aumentó el reclutamiento de neutrófilos y la neutrofilia, mientras que afectó negativamente el reclutamiento y expansión de macrófagos, sugiriendo su papel en la resolución de la inflamación. En general, este estudio demuestra una interacción entre neutrófilos y macrófagos mediada por el inflamasoma, con implicaciones para comprender y potencialmente tratar enfermedades inflamatorias.

This PhD thesis investigates the roles of neutrophils and macrophages in Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Spike (S) protein-induced inflammation and Salmonella enterica serovar Typhimurium (ST) infection, using zebrafish as a model, with a focus on their inflammasome activity. SARS-CoV-2 causes a viral pneumonia in humans, known as coronavirus disease 2019 (COVID-19). The virus's S protein binds to the ACE2 receptor on human epithelial cells, leading to down-regulation of ACE2, which in turn causes vasoconstriction, oxidative stress, and inflammation. Additionally, the S protein contributes to COVID-19-associated cytokine release syndrome (CRS) and activates the NLRP3 inflammasome, a molecular platform involved in clearing intracellular infections and responding to sterile insults. As regards ST, this intracellular bacteria is a relevant pathogen causing foodborne illness and its as excellent model to study the host responses to intracellular bacteria. Neutrophils and macrophages, as first responders to infection, interact to regulate the inflammation. Neutrophils typically arrive first and trigger macrophages to adopt a proinflammatory (M1) phenotype, although anti-inflammatory (M2) macrophages also persist. Although the crosstalk between these two cell types is largely appreciated, the role played by their inflammasome in these interactions are unknown. This PhD thesis involved injecting zebrafish larvae with the S1WT domain of the COVID-19 S protein to induce inflammation, revealing an increase in M1 macrophages without significant changes in neutrophils. Neutrophils ablation reduced inflammation and monocytosis, whereas macrophage ablation had the opposite effect, highlighting their different roles. Further experiments showed that inhibiting the inflammasome in neutrophils attenuated inflammation and neutrophilia in COVID-19-associated CRS and ST infection zebrafish models, whereas macrophage inflammasome inhibition increased inflammation and monocytosis in both models. These results demonstrate that the neutrophil inflammasome is pro-inflammatory, while the macrophages inflammasome plays a pr3viously unappreciated anti-inflammatory role in COVID-19-associated CRS and ST infection models. Furthermore, overactivation of the inflammasome in neutrophils increased bacterial resistance and reduced inflammation, neutropenia and monocytosis, but also led to neutrophil death via gasdermin E (Gsdme)-mediated pyroptosis. This overactivation also resulted in increased macrophage numbers, which, unexpectedly, were more resistant to bacterial killing. In contrast, inhibition of the macrophage inflammasome by specifically expressing DN Asc did not protect these cells from bacterial killing. However, overactivation of the macrophage inflammasome decreased bacterial resistance and exacerbated inflammation and neutrophil recruitment, neutrophilia and monocytopenia in ST infection model. A new transgenic line, Tg(lyz:Dendra-Asc), was generated to track ASC speck in vivo. Neutrophils expressing Dendra-Asc showed two different phenotypes: uniform distribuion of Asc within cell and cells with already formed Asc specks, indicating that Asc overactivation alone can initiate Asc speck formation and inflammasome activation without further stimuli. A significant finding was the transfer of Asc specks from neutrophils to macrophages, indicating direct crosstalk between these cells. Furthermore, S protein-driven inflammation increased the number of activated neutrophils with Asc specks and promoted their release and transfer to bystander neutrophils and macrophages The role of Gsdme, the key effector molecule in pyroptosis, was also examined. Gsdme deficiency and glycine administration rescued neutrophil death caused by inflammasome overactivation, but unexpectedly they reduced monocytosis, revealing the complex interplay between these cells and the Gsdme-dependent anti-inflammatory properties of macrophage inflammasome. To further explore neutrophil-macrophage crosstalk, the COVID-19-asscoaited CRS was used to investigate the role of the chemokine Cxcl8 and its receptors Cxcr1 and Cxcr2. Neutrophils were the first to arrive at the inflammation site, guided by Cxcl8, which bound to the Cxcr1 and Cxcr2 receptors. These findings suggest that rapid neutrophil recruitment to S spike was essential for mounting an appropriate inflammatory response and for subsequent macrophages recruitment and activation. Furthermore, pharmacological inhibition of Cxcr2 minimally affected local inflammation but significantly reduced systemic inflammation and emergency myelopoiesis. CRISPR/Cas9-mediated Cxcr2 knockdown confirmed its role in immune cell recruitment and inflammation. Furthermore, Cxcr1 also played a role in the crosstalk between neutrophils and macrophages, since Cxcr1 deficiency increased neutrophils recruitment and neutrophilia, while impairing macrophage recruitment and expansion, suggesting its role in resolving inflammation. Overall, this study uncovers a crosstalk between neutrophils and macrophages mediated by the inflammasome, with implications for understanding and potentially targeting inflammatory diseases.