Control asistido por magnetismo de ovocitos y embriones a través de nanopartículas unidas a la zona pelúcida

Abstract

El uso de nanopartículas (NP) para aplicaciones biomédicas ha crecido enormemente en las últimas décadas. Entre estos, los desarrollos nanotecnológicos destinados a su aplicación en tecnologías de reproducción asistidas (TRA) se destacaron. A pesar de los importantes avances en este campo, aún no ha sido superada una de las mayores limitaciones de estas tecnologías: la necesidad de manipular los ovocitos y embriones de manera extremadamente delicada y precisa. El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue el desarrollo de un novedoso sistema para la manipulación de ovocitos y embriones mediante el uso de NP con capacidad de ser atraídas magnéticamente, utilizando como enlace con la zona pelúcida (ZP) a la proteína oviductina (OVGP1) y el análisis de la seguridad de su aplicación en TRA. En primer lugar, se evaluó la unión de NP superparamagnéticas con la OVGP1 (NPOv) y se analizó la estabilidad de esta unión. La exitosa conjugación fue confirmada, así como su estabilidad por hasta 31 días después de la conjugación. A continuación, se confirmó la capacidad del complejo NPOv de adherirse específicamente a la parte externa de la ZP de ovocitos madurados in vitro y a embriones producidos in vitro en diversos estadios de desarrollo (4 células, mórulas y blastocistos). En un siguiente estudio se evaluó la viabilidad de gametos y embriones en presencia de NPOv. Para ello, se trabajó primero con el biomodelo porcino en condiciones in vitro donde tras la exposición de gametos a NPOv evaluamos su actividad metabólica mediante un analizador de flujo extracelular, los efectos sobre espermatozoides mediante análisis de parámetros de calidad espermática, los efectos sobre la ZP de mediante el estudio del tiempo de digestión por proteasas, los efectos sobre la capacidad fecundante y sobre el desarrollo embrionario mediante un protocolo de Fecundación in vitro (FIV) y Cultivo embrionario in vitro (CE). Los resultados demostraron la ausencia de efectos de las NPOv sobre vialidad de gametos y desarrollo embrionario. Demostrada la ausencia de efectos sobre gametos y embriones porcinos in vitro, continuamos con el análisis de seguridad biológica sobre el biomodelo conejo. Se analizó el efecto de las NPOv unidas a embriones sobre el desarrollo embrionario in vitro, se estudió el efecto de la presencia de embriones con NPOv in vivo en oviducto y útero de coneja tras su transferencia. Adicionalmente se analizó la respuesta del tejido oviductal

y uterino a la presencia de embriones con NPOv. Los resultados demostraron que no hubo efectos de la presencia de embriones con NPOv en el desarrollo embrionario tanto in vitro como in vivo, ni sobre la tasa de implantación y la tasa de nacidos vivos, ni su peso al nacimiento. Además, no se observaron efectos de la presencia de embriones con NPOv sobre el tejido oviductal ni uterino. Confirmada la inocuidad de las NPOv, se continuó con la validación de su aplicación para la manipulación de ovocitos y embriones. Primero, evaluamos la capacidad de ovocitos y embriones con NPOv de ser atraídos por un campo magnético. Los resultados demostraron que una tanto ovocitos como embriones fueron atraídos en un porcentaje cercano al 90%. Además, se observó que esta tecnología produce la atracción diferencial de ovocitos maduros por sobre los inmaduros. Seguidamente, analizamos el efecto del campo magnético sobre la viabilidad de ovocitos con NPOv tras someterlos a un protocolo de FIV y CE. Se analizó la viabilidad de embriones obtenidos mediante la secuenciación de su ARN. Adicionalmente, el estado oxidativo fue evaluado en ovocitos- NPOv atraídos y en embriones a mediante el estudio de genes relacionados con estrés oxidativo. Los resultados demostraron que no hubo efectos de las NPOv ni del campo magnético sobre los paramaros analizados (tasa de desarrollo embrionario, transcriptoma de los embriones obtenidos, genes relacionados a estrés oxidativo y la intensidad de ROS en ovocitos). En resumen, esta tesis doctoral ha desarrollado y validado una herramienta robusta e inocua, basada en la funcionalización de NP magnéticas con una proteína recombinante que actúa de nexo especifico con la ZP de ovocitos y embriones. Este trabajo ha demostrado que el sistema puede ser utilizado de manera segura para la manipulación ovocitos y embriones mediante campos magnéticos, permitiendo su direccionamiento y/o posicionamiento. Esta novedosa herramienta tiene un gran potencial en las TRA, para su aplicación en diferentes especies

The use of nanoparticles (NP) for biomedical applications have undergone a rapid development in recent decades. Among these, nanotechnological developments aimed at their application in assisted reproduction technologies (ART) stood out. Despite the important advances in this field, one of the greatest limitations of these technologies has not yet been overcome: the need to manipulate oocytes and embryos in an extremely delicate and precise manner. The general objective of this Doctoral Thesis was the development of a novel system for the manipulation of oocytes and embryos through the use of NPs with the capacity to be magnetically attracted, using the protein oviductin (OVGP1) as a link with the zona pellucida (ZP) and the analysis of the safety of its application in ART. Firstly, the binding of superparamagnetic NPs to OVGP1 (NPOv) was evaluated and the stability of this binding was analyzed. Successful conjugation was confirmed, as well as its stability for up to 31 days after conjugation. The ability of the NPOv complex to specifically bind to the external part of the ZP of in vitro matured oocytes and to in vitro produced embryos at various stages of development (4-cell, morulae and blastocysts) was then confirmed. In a subsequent study, the viability of gametes and embryos in the presence of NPOv was evaluated. To do this, we first worked with the porcine model under in vitro conditions where, after the exposure of gametes to NPOv, we evaluated its metabolic activity using an extracellular flux analyzer, the effects on spermatozoa by analyzing sperm quality parameters, the effects on the ZP by studying the digestion time by proteases, the effects on fertilizing capacity and on embryonic development during an in vitro fertilization (IVF) and embryo culture (CE) protocol. The obtained results demonstrated the absence of effects of NPOv on gamete viability and embryo development. Once the absence of effects on porcine gametes and embryos in vitro was demonstrated, we continued with the biological safety analysis on the rabbit model. The effect of NPOv attached to embryos on embryo development in vitro was analyzed, and the effect of the presence of embryos with NPOv in vivo in the oviduct and uterus of rabbits after their transfer was studied. Additionally, the response of the oviductal and

uterine tissue to the presence of embryos with NPOv was analyzed. The results showed that there were no effects of the presence of embryos with NPOv on embryo development both in vitro and in vivo, nor on the implantation rate and the live birth rate, nor their birth weight. In addition, no effects of the presence of embryos with NPOv on oviductal or uterine tissue were observed. Once the safety of NPOv was confirmed, the validation of its application for the manipulation of oocytes and embryos continued. First, we evaluated the capacity of oocytes and embryos with NPOv to be attracted by a magnetic field. The results showed that both oocytes and embryos were attracted in a percentage close to 90%. In addition, it was observed that this technology produces the differential attraction of mature oocytes over immature ones. Next, we analyzed the effect of the magnetic field on the viability of oocytes with NPOv after subjecting them to an IVF and CE protocol. The viability of embryos obtained was analyzed by sequencing their RNA. Additionally, the oxidative status was evaluated in attracted NPOv oocytes and in embryos by studying genes related to oxidative stress. The results showed that there were no effects of the NPOv or the magnetic field on the analyzed parameters (rate of embryonic development, transcriptome of the embryos obtained, genes related to oxidative stress and the intensity of ROS in oocytes). In summary, this doctoral thesis has developed and validated a robust and harmless tool, based on the functionalization of magnetic NPs with a recombinant protein that acts as a specific link with the ZP of oocytes and embryos. This work has demonstrated that the system can be safely used for the manipulation of oocytes and embryos using magnetic fields, allowing their direction and/or positioning. This novel tool has great potential in ART, for its application in different species