Molecular determinants involved in conceptus elongation in ungulates

Abstract

El desarrollo embrionario de los ungulados –grupo que incluye a las principales especies de mamíferos de interés ganadero– se caracteriza por un periodo preimplantacional largo que puede dividirse en dos fases. La primera abarca desde la fecundación hasta la eclosión del blastocisto y es común a todos mamíferos, siendo la única fase presente en ratones y humanos, en los que el embrión implanta justo después de la eclosión. En contraste, el desarrollo preimplantacional de los ungulados se extiende en una segunda fase denominada elongación del concepto. La elongación del concepto se caracteriza por la proliferación masiva de las membranas extraembrionarias y por la formación de un disco embrionario plano en el que tiene lugar la gastrulación antes de la implantación. La elongación del concepto es el periodo más susceptible a pérdidas embrionarias y, por ello, el estudio de los procesos que tienen lugar durante esta fase es crucial para reducir las pérdidas embrionarias en animales de granja y aporta información relevante para entender el desarrollo embrionario humano. Esta tesis, dividida en cinco capítulos, analiza diferentes aspectos moleculares del desarrollo preimplantacional bovino, centrándose en la fase de la elongación del concepto. El Capítulo 1, describe importantes diferencias en el desarrollo embrionario preimplantacional entre diferentes especies de mamíferos, detallando distintos marcadores específicos de linaje que pueden utilizarse para evaluar la calidad embrionaria en ungulados. En el resto de los capítulos se emplea la tecnología de edición génica CRISPR/Cas9 para realizar estudios de pérdida de función que sirven para conocer la función de genes específicos durante el desarrollo preimplantacional. Los experimentos emplean aproximaciones in vitro –incluyendo un novedoso sistema de desarrollo post- eclosión– e in vivo para determinar la capacidad de desarrollo de los embriones knock- out (KO). Los capítulos 2 y 3 analizan la capacidad de desarrollo de embriones bovinos dobles portadores de haplotipos deletéreos, que son alelos que causan mortalidad embrionaria o fetal en homocigosis. El capítulo 2 estudia la capacidad de desarrollo de embriones dobles portadores del Haplotipo Holstein 3 (HH3), que consiste en una sustitución T/C que impide la formación de la proteína SMC2 funcional. SMC2 es un componente esencial de complejos proteicos que median el ensamblaje y segregación de los cromosomas durante la mitosis y meiosis. En un primer estudio se vio que los embriones dobles portadores del haplotipo no eran capaces de desarrollarse hasta día embrionario (E) 14. Para precisar cuándo se producía el arresto en el desarrollo, se

generaron embriones KO para SMC2 (funcionalmente equivalentes a los dobles portadores HH3) mediante la tecnología CRISPR. Los embriones KO para SMC2 fueron capaces de alcanzar el estadio de blastocisto, pero mostraron una clara disminución de la proliferación celular y no consiguieron sobrevivir hasta Día (D) 12 in vitro, no siendo capaces de inducir el reconocimiento materno de la gestación. El Capitulo 3 evalúa la capacidad de desarrollo de embriones dobles portadores del Haplotipo Holstein 5 (HH5), que carecen de la proteína TFB1M, implicada en la traducción mitocondrial. Inicialmente, se observó que los embriones dobles portadores mostraban un defecto severo en la proliferación de las membranas extraembrionarias a E14. Para estudiar su capacidad de desarrollo en estadios previos, se generaron embriones KO para TFB1M, funcionalmente equivalentes a los dobles portadores HH5. Los embriones KO para TFB1M no mostraron ningún defecto en el desarrollo hasta D12 in vitro, indicando que el desarrollo de los embriones dobles portadores de HH5 se detiene en la transición entre concepto esférico y tubular, antes del reconocimiento de la gestación. El Capítulo 4 analiza la función durante el desarrollo embrionario del receptor de señalización lipídica PPARG. Para ello, se analizó el desarrollo de embriones bovinos KO para PPARG en D8 y D12 in vitro y se realizaron transferencias embrionarias heterólogas para evaluar su capacidad de desarrollo in vivo durante las primeras etapas de la elongación. Los embriones sin PPARG fueron capaces de desarrollarse normalmente hasta estadios elongados equivalentes a E14, mostrando que la señalización mediada por PPARG en el embrión no es necesaria para la elongación temprana del concepto bovino. Finalmente, el capítulo 5 explora un dogma de la biología del desarrollo establecido en base al modelo de ratón: el papel esencial del factor de transcripción TEAD4 en la diferenciación del trofoectodermo y la formación del blastocisto. Siguiendo un diseño experimental similar al del capítulo 4, se observó que los embriones bovinos KO para TEAD4 se desarrollaron de forma normal hasta el estadio de blastocisto in vitro y fueron capaces de alcanzar estadios tardíos de desarrollo (concepto tubular de E14) in vivo sin mostrar defectos evidentes en la proliferación del trofoectodermo. También se observó que TEAD4 tampoco era necesario para la diferenciación del trofoectodermo y formación del blastocisto en conejos, una especie que comparte el mismo clado (Glires) que los roedores. Estos resultados prueban que el papel crucial de TEAD4 en la diferenciación del trofoectodermo es exclusivo de roedores.

Embryo development in ungulates –a group including the most relevant mammalian livestock species– is characterized by a long preimplantation period that can be divided into two phases. The first spans from fertilization to blastocyst hatching, it is common to all mammals and accounts for the whole preimplantation period in rodents and humans, where implantation occurs right after blastocyst hatching. In contrast, ungulate embryos extend their preimplantation development in a second phase termed conceptus elongation. Conceptus elongation is characterized by a massive proliferation of the extraembryonic membranes and by the formation of a flat embryonic disc, which undergo gastrulation before implantation. Conceptus elongation is the most susceptible period to embryonic losses and, thereby, the study of the processes occurring during this phase is crucial to reduce embryonic losses in farm animals and provides relevant information to understand human embryo development. This thesis, divided into five chapters, analyzes the molecular aspects of bovine preimplantation development, focusing on conceptus elongation. Chapter 1 describes the main differences in preimplantation embryo development between mammals, detailing different lineage-specific markers that can be used to assess embryo quality in ungulates. The remaining chapters employ CRISPR/Cas9 gene editing technology to perform loss- of-function studies that provide new insights into the function of specific genes during preimplantation development. Experiments employ in vitro - including a novel post- hatching development system - and in vivo approaches to determine the developmental ability of knock-out (KO) embryos. Chapters 2 and 3 analyze the developmental ability of double-carrier bovine embryos of deleterious haplotypes, which are alleles that cause embryonic or foetal mortality in homozygosis. Chapter 2 studies the developmental ability of Holstein Haplotype 3 (HH3) double-carrier embryos, which harbour of a T/C substitution that prevents the formation of a functional SMC2 protein. SMC2 is an essential component of protein complexes required for chromosome assembly and segregation during mitosis and meiosis. A preliminary study observed that double-carrier embryos were not able to develop until embryonic day (E) 14. To determine precisely when the developmental arrest occurs, SMC2 KO embryos (functionally equivalent to HH3 double carriers) were generated using CRISPR technology. SMC2 KO embryos were able to develop to the blastocyst stage but showed impaired cell proliferation and failed to survive up to Day (D) 12 in vitro, being unable to trigger maternal recognition of pregnancy.

Chapter 3 evaluates the developmental ability of double-carrier embryos of the Holstein haplotype 5 (HH5), which lack TFB1M, a protein involved in mitochondrial translation. E14 double-carrier embryos were found to display a severe defect in the proliferation of extraembryonic membranes. Subsequently, TFB1M KO embryos (functionally equivalent to double HH5 carriers) were generated to assess their developmental ability before E14. TFB1M KO embryos showed no developmental defects until D12 in vitro, indicating that the development of HH5 double-carrier embryos is arrested at the transition between spherical and tubular conceptus, prior to maternal recognition of pregnancy. Chapter 4 investigates the role of the lipid signaling receptor PPARG during early embryo development. The development of PPARG KO bovine embryos was analyzed at D8 and D12 in vitro and heterologous embryo transfers were performed to assess their in vivo developmental ability to early elongation stages. Embryos without PPARG showed no developmental abnormalities, being able to develop to E14 in vivo and indicating that PPARG-mediated signaling in the embryo is not required for early bovine conceptus elongation. Finally, Chapter 5 explores an established dogma in developmental biology, based on the mouse model: the essential role of the transcription factor TEAD4 in trophectoderm differentiation and blastocyst formation. Following an experimental design similar to that of Chapter 4, it was observed that TEAD4 KO bovine embryos developed normally to the blastocyst stage in vitro and were able to reach later developmental stages (E14 tubular conceptus) in vivo without showing obvious defects in trophectoderm proliferation. Furthermore, it was observed that TEAD4 was not required for trophectoderm differentiation and blastocyst formation in rabbits, a species that shares the same clade (Glires) than rodents. These results demonstrate that the crucial role of TEAD4 in trophectoderm differentiation is unique to rodents.