Antithrombin role beyond hemostasis

Abstract

La antitrombina es una glicoproteína secretada principalmente por el hígado y perteneciente a la superfamilia de las serpinas, que son inhibidores de serín proteasas, como algunas proteínas de la cascada de la coagulación, siendo, de hecho, el principal inhibidor fisiológico de esta cascada. La antitrombina tiene gran flexibilidad estructural, permitiéndole inhibir proteasas de la coagulación y adoptar distintas conformaciones: nativa, activada por heparina, rota, latente y prelatente. Las conformaciones latente y prelatente, con el loop reactivo internalizado en la lámina beta central, se forman in vitro al incubar la antitrombina nativa a temperaturas elevadas. La prelatente conserva su capacidad inhibitoria, aunque con menor afinidad por la heparina, y se presenta en vivo en bajas concentraciones. Además de su función en la hemostasia, la antitrombina tiene funciones anti-angiogénicas, anti-inflamatorias, anti-apoptóticas y anti-virales. Nuestro grupo demostró que la antitrombina activada por heparina también tiene un efecto anti-tumoral sobre células de glioblastoma, probablemente mediado por la inhibición de la enteropeptidasa.

El glioblastoma es el tumor maligno primario más agresivo del sistema nervioso central en adultos, con una incidencia global menor de 10 por cada 100000 personas. A pesar de tratamientos agresivos, la mediana de supervivencia es de 12-15 meses tras el diagnóstico. Su baja tasa de supervivencia se debe a su heterogeneidad, capacidad invasiva, barrera hematoencefálica y células madre de glioma. La antitrombina, dada su diversidad conformacional y efectos pleiotrópicos, podría ser una candidata para un nuevo tratamiento del glioblastoma.

Los objetivos de esta tesis han sido: 1. Caracterizar la función antitumoral de la antitrombina prelatente sobre células de glioblastoma multiforme. 2. Estudiar el mecanismo celular subyacente a la función antitumoral de la antitrombina nativa y prelatente en células de glioblastoma multiforme. 3. Identificar el receptor potencial de la antitrombina en células de glioblastoma y validar los resultados in vitro en un modelo preclínico usando organoides y muestras de pacientes con glioblastoma multiforme.

Se purificó antitrombina prelatente a partir de plasma humano mediante cromatografía de afinidad por heparina, incubando antitrombina nativa a 60ºC durante 30 horas. Se caracterizaron las conformaciones nativa y prelatente evaluando la formación de complejos con FXa o trombina, y la afinidad por heparina. Se trataron células de glioblastoma U87 y/o U251 con 2.16 µM de antitrombina nativa, prelatente, o con buffer A (control), durante 11 horas.

En el primer capítulo, se caracterizó la función antitumoral de la antitrombina en células U87, evaluando su interacción con la enteropeptidasa. Se determinó que la antitrombina prelatente inhibe la enteropeptidasa, aunque la nativa mostró un efecto inhibidor mayor en presencia de heparina. Se estableció que la concentración óptima de antitrombina para su efecto antitumoral es de 2.16 µM. Se observó que la antitrombina prelatente reduce la migración e invasión de células U87 sin heparina y más eficientemente que la nativa. La antitrombina prelatente también inhibe la expresión de VEGFA y STAT3, reduciendo la resistencia al tratamiento en glioblastoma multiforme.

En el segundo capítulo, se estudió el mecanismo subyacente a la función antitumoral de la antitrombina prelatente. Un array de expresión mostró 2477 genes sobreexpresados y 6760 infraexpresados. Se seleccionaron 3 miRNAs alterados en el array relacionados con VEGFA para evaluar su implicación en angiogénesis, aunque no se obtuvieron resultados significativos. Se encontró que la antitrombina inhibe genes reguladores del ciclo celular como pRB y E2F4, inhibiendo la proliferación y la fase S del ciclo celular en células U87, pero no en U251.

En el tercer capítulo, se identificó a la distonina como potencial receptor de la antitrombina en células U87. La antitrombina nativa y prelatente mostraron interacción con la distonina, implicada en la inhibición de la proliferación tumoral de células U87. Se evaluó la capacidad anti-invasiva de la antitrombina en un modelo preclínico con organoides y neuroesferas generadas a partir de la biopsia al diagnóstico y recaída de un paciente con glioblastoma, demostrando que ambas inhiben la invasión tumoral.

Esta tesis demuestra el efecto antitumoral in vitro de las antitrombinas nativa y prelatente, asociadas con reducción de migración e invasión tumoral, menor resistencia al tratamiento, parada del ciclo celular, menor proliferación y función anti-angiogénica. La identificación de la distonina como potencial receptor podría ayudar a diseñar terapias dirigidas. Los resultados in vivo apoyarían el potencial terapéutico de la antitrombina prelatente en el glioblastoma.

Antithrombin is a glycoprotein secreted mainly by the liver that belongs to the serpin superfamily, which are serin protease inhibitors, such as some proteins of the coagulation cascade, being, in fact, the main physiological inhibitor of this cascade. Antithrombin has great structural flexibility, allowing it to inhibit coagulation proteases and to adopt different conformations: native, heparin-activated, cleaved, latent and prelatent. The latent and prelatent conformations, with the reactive loop internalised in the central β-sheet, are formed in vitro by incubating native antithrombin at elevated temperatures. Prelatent antithrombin retains its inhibitory capacity, albeit with lower affinity for heparin, and occurs in vivo at low concentrations. In addition to its role in haemostasis, antithrombin has anti-angiogenic, anti-inflammatory, anti-apoptotic and anti-viral functions. Our group demonstrated that heparin-activated antithrombin also has an anti-tumour effect on glioblastoma cells, probably mediated by enteropeptidase inhibition.

Glioblastoma is the most aggressive primary malignant tumour of the central nervous system in adults, with an overall incidence of less than 10 per 100,000 people. Despite aggressive treatments, the median survival is 12-15 months after diagnosis. This low survival rate is due to its high heterogeneity and invasiveness, and presence of the blood-brain barrier and glioma stem cells. Antithrombin, given its conformational diversity and pleiotropic effects, could be a candidate as a new treatment for glioblastoma.

The main objectives of this doctoral thesis were: Chapter 1) Characterization of the antitumor functions of prelatent antithrombin on glioblastoma multiforme cells. Chapter 2) Study of the cellular mechanisms underlying the antitumor effect of native and prelatent conformations of antithrombin on glioblastoma cell lines. Chapter 3) Identification of the potential receptor of antithrombin in glioblastoma multiforme cells and validation of the in vitro results in a preclinical model based on the use of organoids and in samples of glioblastoma multiforme patients.

Prelatent antithrombin was purified from healthy human plasma donors by heparin affinity chromatography, incubating native antithrombin at 60°C for 30 hours. The native and prelatent conformations were characterised by assessing complex formation with FXa or thrombin, and affinity for heparin. U87 and/or U251 glioblastoma cells were treated with 2.16 µM native, prelatent, or buffer A (control) antithrombin for 11 hours.

In the first chapter, the anti-tumour function of antithrombin in U87 cells was characterised by assessing its interaction with enteropeptidase. It was determined that prelatent antithrombin inhibits enteropeptidase, although native antithrombin showed a greater inhibitory effect in the presence of heparin. The optimal concentration of antithrombin for its anti-tumour effect was found to be 2.16 µM. Prelatent antithrombin was able to reduce U87 cell migration and invasion without heparin and more efficiently than native antithrombin. Prelatent antithrombin also inhibits VEGFA and STAT3 expression, reducing treatment resistance in glioblastoma multiforme.

In the second chapter, the mechanism underlying the anti-tumour function of prelatent antithrombin was studied. An expression array showed 2477 over-expressed and 6760 under-expressed genes in U87 cells. Three altered miRNAs in the array related to VEGFA were selected to assess their involvement in angiogenesis, although no significant results were obtained. Antithrombin was found to inhibit cell cycle regulatory genes such as pRB and E2F4, inhibiting proliferation and S phase of the cell cycle in U87 cells, but not in U251.

In the third chapter, dystonin was identified as the potential receptor of antithrombin in U87 cells. Native and prelatent antithrombin showed interaction with dystonin, demonstrating also its implication in the inhibition of tumour proliferation of U87 cells. The anti-invasive capacity of antithrombin was evaluated in a preclinical model with organoids and neurospheres generated from the biopsy at diagnosis and relapse of a patient with glioblastoma, demonstrating that both inhibit tumour invasion.

This thesis demonstrates the in vitro antitumour effect of native and prelatent conformations of antithrombin, associated with reduced tumour migration and invasion, reduced resistance to treatment, cell cycle arrest, reduced proliferation and anti-angiogenic function. The identification of dystonin as a potential receptor could help design targeted therapies. In vivo results would support the therapeutic potential of prelatent antithrombin in glioblastoma.