Identification of new risk factors involved in the progression of Philadelphia Negative Chronic Myeloproliferative Neoplasms

Abstract

Introducción: Las neoplasias mieloproliferativas son hemopatías caracterizadas por la expansión clonal de líneas celulares mieloides en la médula ósea (MO), lo que conduce a una producción excesiva de células sanguíneas. Se clasifican en policitemia vera (PV), trombocitemia esencial (TE) y mielofibrosis (MF). Estas tres constituyen las neoplasias mieloproliferativas clásicas Filadelfia negativas (NMP), ya que carecen del gen de fusión BCR::ABL1, que se observa en la leucemia mieloide crónica (LMC). Los pacientes con NMP comparten características clínicas como esplenomegalia, síntomas constitucionales y mayor riesgo de eventos trombóticos. La mediana de supervivencia varía entre los subtipos, siendo la MF la de menor supervivencia. Las mutaciones en JAK2, CALR y MPL son factores clave en la NMP y activan la vía de señalización JAK/STAT. La inflamación desempeña un papel crucial en el desarrollo y la progresión de la NMP, contribuyendo a los síntomas, la fibrosis y la progresión de la enfermedad. La inflamación crónica también puede provocar complicaciones cardiovasculares y aumentar la susceptibilidad a otras neoplasias. MiR-146a se ha identificado como regulador de la vía inflamatoria NF-κB, cuya desregulación está relacionada con diversas enfermedades inflamatorias. Los ratones carentes de miR-146a (KO) desarrollan un fenotipo mieloproliferativo y fibrótico similar a la MF, lo que ofrece un modelo para estudiar los mecanismos inflamatorios en ausencia de mutaciones conductoras. Comprender la relación entre la inflamación y los procesos malignos es crucial para desarrollar tratamientos eficaces para los pacientes con NMP. Objetivos: Investigar el papel de la inflamación, específicamente la vía NF-κB, en la progresión de la NMP. Los tres objetivos específicos incluyen estudiar el impacto de miR-SNPs de MIR146A en la susceptibilidad y progresión a estadios avanzados de la NMP, determinar si la inhibición de la señalización NF-κB y/o JAK/STAT puede revertir el fenotipo tipo MF en ratones KO envejecidos, y evaluar si la inhibición de JAK2/IRAK1 puede prevenir el desarrollo del fenotipo tipo MF en ratones KO más jóvenes. Material y métodos: Para ello, se examinó la relación entre ambas vías NF-κB y JAK/STAT en pacientes con NMP, así como en el modelo murino miR-146a-KO y en un modelo celular. Se recogió ADN de pacientes y controles para la determinación del genotipo y se analizaron las citoquinas plasmáticas. Los ratones KO de edad avanzada, que presentaban el fenotipo, fueron tratados con ruxolitinib (inhibidor JAK1/2), BMS-345541 (inhibidor IKKα/β), ambos inhibidores en combinación, o pacritinib (inhibidor JAK2/IRAK1) para revertir el fenotipo, mientras que los ratones más jóvenes, sin desarrollar el fenotipo, fueron tratados con pacritinib para prevenir o retrasarlo. Se realizó un hemograma completo, cuantificación de citoquinas plasmáticas, estudio del bazo (macroscópico, citometría de flujo, análisis histológico y análisis de proteínas por western blot) y estudio histológico de la MO de fémures. Como modelo de hematopoyesis clonal se empleó la línea celular humana SET2 (JAK2V617F). Se incubaron con los mismos tratamientos descritos anteriormente, y se analizó la expresión proteica mediante western blot. Además, estas células se cocultivaron con una línea estromal (HS-27A) con los fármacos. La expresión génica y proteica del colágeno (COL1A1) de HS-27A se analizó mediante RT-qPCR e inmunofluorescencia, respectivamente. Resultados: El genotipo rs2431697-TT se asoció con MF, especialmente con la MF post-PV/TE. Los pacientes con este genotipo presentaron una menor tasa de supervivencia libre de MF, eran más propensos a evolucionar a MF secundaria y mostraron niveles elevados de citoquinas inflamatorias. Además, los ratones miR-146a-KO mostraron un aumento de la señalización STAT3 con el envejecimiento. Aunque todos los tratamientos provocaron una reducción del tamaño del bazo y una restauración parcial de su arquitectura, sólo la inhibición de NF-κB condujo a una reducción de la hematopoyesis extramedular, la fibrosis de la MO y la osteoesclerosis, junto con una atenuación del estado inflamatorio exacerbado. Sin embargo, la terapia combinada empeoró la anemia al inducir hipoplasia de la MO. La terapia combinada y pacritinib redujeron la señalización NF-κB y JAK/STAT en células SET-2 mutadas con JAK2. Además, el tratamiento combinado redujo la producción de COL1A1 en el cocultivo SET-2+HS-27A. Pacritinib previno la esplenomegalia, la fibrosis de la reticulina de la médula ósea y la osteoesclerosis observadas en ratones KO sin tratar. También evitó la mieloproliferación, la pérdida de arquitectura esplénica y la hematopoyesis extramedular. Además, se observó que pacritinib atenuaba el entorno proinflamatorio, evitando el aumento de citoquinas inflamatorias (CXCL1 y TNFα) sin inducir citopenias, sino más bien lo contrario. Los ratones tratados con pacritinib mostraron recuentos plaquetarios más elevados, mientras que los recuentos eritrocitarios fueron mayores en los ratones tratados a largo plazo. Por último, pacritinib redujo la producción de COL1A1 en el modelo de cocultivo. Conclusiones: Este proyecto pone de manifiesto la importancia de la inflamación en el desarrollo y progresión de la NMP, en particular de la MF, como potencial diana terapéutica. El genotipo rs2431697-TT, asociado a niveles más bajos de miR-146a, se erige como un nuevo factor pronóstico de la progresión de la MF. En ratones envejecidos con características similares a la MF, la inhibición de NF-κB sola o en combinación con JAK/STAT reduce la inflamación, la esplenomegalia y revierte la trombocitopenia y la fibrosis de la MO. Los estudios con líneas celulares humanas mutadas en JAK2 mostraron una reducción de la expresión de COL1A1. Todo ello respalda su potencial terapéutico en las enfermedades inflamatorias. La inhibición dual temprana de JAK/STAT y NF-κB en ratones KO jóvenes previene los síntomas similares a la MF, también apoyada por los resultados en líneas celulares, enfatizando los beneficios de la intervención temprana en el manejo de la enfermedad.

Introduction: Myeloproliferative neoplasms are hematological disorders characterized by the clonal expansion of myeloid cell lines in the bone marrow (BM), leading to excessive blood cell production. They are classified as polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET), and myelofibrosis (MF). These three constitute the classic Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms (MPN), as they lack the BCR::ABL1 fusion gene, seen in chronic myeloid leukemia (CML). MPN patients share clinical features like splenomegaly, constitutional symptoms, and a higher risk of thrombotic events. The median survival varies among the subtypes, with MF having the lowest. Mutations in JAK2, CALR, and MPL are key drivers in MPN, activating the JAK/STAT signaling pathway. Inflammation plays a crucial role in the development and progression of MPN, contributing to symptoms, fibrosis, and disease progression. Chronic inflammation can also lead to cardiovascular complications and increase susceptibility to other neoplasms. MiR-146a has been identified as a regulator of the inflammatory NF-κB pathway, with dysregulation linked to various inflammatory diseases. Mice lacking miR-146a (KO) develop a myeloproliferative and fibrotic MF-like phenotype, offering a model to study inflammatory mechanisms in the absence of driver mutations. Understanding the relationship between inflammation and malignant processes is crucial for developing effective treatments for MPN patients. Objectives: To investigate the role of inflammation, specifically the NF-κB pathway, in the progression of MPN. Three specific objectives include studying the impact of MIR146A miR-SNPs on susceptibility and progression to advanced stages of MPN, determining if inhibition of NF-κB and/or JAK/STAT signaling can reverse the MF-like phenotype in aged KO mice, and evaluating if inhibition of JAK2/IRAK1 can prevent the development of MF-like phenotype in younger KO mice. Material and methods: To this end, the relationship between both NF-κB and the JAK/STAT pathways was examined in patients with MPN, as well as in the miR-146a-KO murine model and a cellular model. DNA from patients and controls was collected for genotyping, and plasma cytokines were analyzed. Aged KO mice, exhibiting the phenotype, were treated either with ruxolitinib (JAK1/2 inhibitor), BMS-345541 (IKKα/β inhibitor), both inhibitors in combination, or pacritinib (JAK2/IRAK1 inhibitor) to reverse the phenotype, while younger mice, prior MF-like phenotype, were treated with pacritinib to prevent or delay phenotype development. A complete blood count, plasma cytokine quantification, spleen study (macroscopic, flow cytometry, histological analysis and protein analysis by western blot) and histological study of the femurs BM were performed. The human SET2 cell line was employed as a clonal hematopoiesis model (JAK2V617F). Cultures of these cells were incubated with the same treatments previously described, and protein expression was analyzed by western blot. Additionally, these cells were co-cultured with a stromal line (HS-27A) with the drugs. Collagen (COL1A1) gene and protein expression of HS-27A were analyzed by RT-qPCR and immunofluorescence, respectively. Results: The rs2431697-TT genotype was associated with MF, especially post-PV/TE MF. Patients with this genotype had a lower MF-free survival rate, were more likely to progress to secondary MF, and had elevated levels of inflammatory cytokines. Additionally, miR-146a-KO mice showed increased STAT3 signaling with aging. While all treatments resulted in a reduction of spleen size and a partial restoration of spleen architecture, only NF-κB inhibition led to a reduction of extramedullary hematopoiesis, BM fibrosis and osteosclerosis, along with an attenuation of the exacerbated inflammatory state. However, the combination therapy worsened anemia by inducing BM hypoplasia. Combination therapy and pacritinib reduced NF-κB and JAK/STAT signaling in JAK2-mutated SET-2 cells. Moreover, the combined treatment reduced COL1A1 production in the SET-2+HS-27A co-culture. Pacritinib prevented splenomegaly, BM reticulin fibrosis and osteosclerosis observed in age-matched untreated KO mice. It also avoided the myeloproliferation, loss of splenic architecture, and extramedullary hematopoiesis. Moreover, pacritinib was found to attenuate the pro-inflammatory environment, preventing the increase of inflammatory cytokines (CXCL1 and TNFα) without inducing cytopenias, but rather the opposite. Pacritinib-treated mice exhibited higher platelet counts, while erythrocyte counts were higher in treated mice with longer treatment durations. Finally, pacritinib reduced COL1A1 production in the co-culture model. Conclusions: This thesis project highlights the importance of inflammation in the development and progression of MPN, particularly MF, as a potential therapeutic target. The rs2431697-TT genotype, associated with lower miR-146a levels, stands as a novel prognostic factor for MF progression. In aged mice with MF-like features, inhibition of NF-κB alone or in combination with JAK/STAT reduces inflammation, splenomegaly, and reverses thrombocytopenia and BM fibrosis. JAK2-mutated human cell line studies showed reduced COL1A1 expression. All this support the therapeutic potential in inflammatory diseases. Early dual inhibition of JAK/STAT and NF-κB in young KO mice prevents MF-like symptoms, also supported by cell line results, emphasizing the benefits of early intervention in disease management.