Daily rhythms of physiological processes in fish : synchronization to light and feeding cycles and effects on the molecular clock, epigenetics and welfare

Abstract

Objetivos del Estudio 1. Investigar la presencia de un ritmo diario en la respuesta al estrés en la lubina europea y cómo la temporada del año modula la respuesta. 2. Explorar la presencia de un ritmo diario en los genes involucrados en la regulación de la alimentación y la digestión en la lubina europea. 3. Estudiar la presencia de un ritmo diario en los mecanismos epigenéticos y su conexión con los genes del reloj biológico en la lubina europea. 4. Comprender cómo la combinación de diferentes factores estresantes (privación de alimento y densidad) puede afectar los genes del reloj biológico y los genes relacionados con los mecanismos epigenéticos en la lubina europea. 5. Investigar el ritmo diario de la respuesta al estrés del pez cebra knockout para el receptor de glucocorticoides (gr-/-) y la influencia del momento de la alimentación. Metodología 1. Los peces se han mantenido en condiciones naturales antes del muestreo. Durante el muestreo, los peces de control se han muestreado directamente, mientras que los peces tratados han sido expuestos al aire durante 1 minuto y muestreados 1 hora después. El muestreo se ha realizado en un ciclo de 24 horas con 7 puntos de muestreo donde se han recolectado muestras de plasma e hígado, y los experimentos se han repetido en diciembre y junio. 2. Los peces se han mantenido en condiciones naturales y se les ha alimentado en dos momentos diferentes del día. Se han recolectado hipotálamo e hígado en un muestreo de 24 horas en 7 puntos de muestreo diferentes para analizar los factores que regulan el apetito y la digestión. 3. Los peces se han mantenido en condiciones naturales y se les ha alimentado en dos momentos diferentes del día. Se han recolectado hígado e hipotálamo en un muestreo de 24 horas en 7 puntos de muestreo diferentes para verificar la presencia de un ritmo diario en los genes del reloj biológico o factores involucrados en procesos epigenéticos. 4. Los peces se han mantenido en condiciones naturales y se han dividido en 4 grupos con diferentes condiciones de densidad y alimentación. Para probar el efecto crónico del estrés, los muestreamos en diferentes días durante el día o durante la noche. Se recolectaron muestras de hígado para probar la respuesta de los genes del reloj biológico y genes epigenéticos. 5. Los peces mutantes y de tipo salvaje se han alimentado respectivamente en ML o MD y después de un mes se muestrearon en un ciclo de 24 horas para recolectar cerebro. Se realizó un análisis de Q-PCR para analizar el ritmo de los genes del reloj biológico y los genes epigenéticos. Conclusiones 1. La lubina europea es particularmente sensible al estrés, pero la respuesta cambia no solo durante el día sino también durante el año. 2. El momento de la alimentación es un fuerte sincronizador y es importante que coincida con la fase de actividad del animal. Alimentar a la lubina europea en un momento que altera su fase de descanso ha llevado en la mayoría de los casos a una pérdida del ritmo. 3. Los genes del reloj biológico y los genes epigenéticos se expresan rítmicamente en el cerebro y el hígado de la lubina europea, y el momento de la alimentación tuvo un efecto mayor en el hígado, promoviendo la pérdida del ritmo de los genes epigenéticos cuando los peces se alimentaron durante la fase de descanso. 4. La densidad y la restricción calórica pueden afectar de manera diferente los genes del reloj biológico y los genes epigenéticos en la lubina europea, pero los procesos de metilación son los más afectados. 5. El sistema de glucocorticoides y el momento de la alimentación ejercen un fuerte efecto sobre los genes del segundo bucle de los genes del reloj biológico en el cerebro del pez cebra. Por el contrario, el efecto sobre los genes epigenéticos fue menor.

Objectives: 1. Investigate the presence of a daily rhythm in the stress response in European sea bass and how the season of the year modulate the response. 2. Explore the presence of a daily rhythm in the genes involved in the regulation of feeding and digestion in European sea bass. 3. Study the presence of a daily rhythm in epigenetic mechanism and their connection to the clock genes in European sea bass. 4. Understand how different stressor combined (food deprivation and density) can affect the clock genes and genes related to epigenetic mechanisms in European sea bass. 5. Investigate the daily rhythm of the stress response of Zebrafish knockout for glucocorticoid receptor (gr-/-) and the influence of feeding time.

Metodology 1. The fish have been kept in natural conditions before the sampling. During the sampling, control fish have been sampled directly while treated fish have been exposed to air for 1 minute and sampled 1h later. The sampling has been conducted in a 24h cycle with 7 sampling point where samples of plasma and liver have been collected and the experiments have been repeated in December and June. 2. The fish have been kept in natural condition and fed at two different moments of the day. Hypothalamus and liver have been collected in a 24h sampling at 7 different sampling point to analyze factors which regulate appetite and digestion. 3. The fish have been kept in natural condition and fed at two different moments of the day. Liver and hypothalamus have been collected in a 24h sampling at 7 different sampling points to check the presence of a daily rhythm in the clock genes or factors involved in epigenetic processes. 4. Fish have been kept in natural condition and divided in 4 groups with different density and feeding conditions. To test the chronic effect of the stress we sampled them in different days during the day or during the night. Liver samples were collected to test the response of the clock gene and epigenetic genes. 5. Mutants and wild type fish have been fed respectively at ML or MD and after one month sampled in a 24-hours cycle to collect brain. Q-PCR analysis have been carried out to analyze the rhythm of clock and epigenetic genes.

Conclusions 1. European sea bass is particularly sensitive to stress but the response change not only during the day but also during the year. 2. Feeding time is a strong synchronizer and is important that match the phase of activity of the animal. Feeding European sea bass in a moment that alter their resting phase, has led in most cases to a loss of the rhythm. 3. Clock and epigenetic genes are rhythmically expressed in the brain and liver of European sea bass and feeding time had major effect on liver, promoting the loss of the rhythm of epigenetic genes when fish were fed during the resting phase. 4. Density and low calories restriction can affect differently clock and epigenetic genes in European sea bass, but the methylation processes are the most affected. 5. The glucocorticoid system and feeding time exert a strong effect on the genes of the secondary loop of the clock genes in the brain of Zebrafish. On the contrary, the effect on the epigenetic genes was lower.