New mechanisms for regulating the response to photooxidative and oxidative stress in the bacterium Myxococcus xanthus and their evolutionary conservation

Abstract

Estudios recientes han demostrado que la proteína transmembranal CarF es necesaria para la respuesta a la luz de la bacteria de suelo Gram negativa Myxococcus xanthus por su función como plasmaniletanolamina desaturasa (PEDS1), enzima que genera el enlace vinil-éter en los plasmalógenos (unos glicerofosfolípidos especiales que señalizan en estrés fotooxidativo en M. xanthus). El primer objetivo ha consistido en demostrar que los homólogos animales de CarF, conocidos como TMEM189, corresponden a la ampliamente buscada PEDS1 de mamíferos, y explorar el papel de estos lípidos en células humanas y dos animales modelo. Las células TMEM189-knockout mostraron una ausencia total de plasmalógenos, acompañada de una acumulación de sus precursores y de las especies minoritarias C14-Cer y C14-CerP con funciones señalizadoras, confirmando así que TMEM189 es la única PEDS en humanos. Además, la proteína de fusión EGFP-TMEM189 se localizó en el retículo endoplasmático (ER) y complementó la falta de TMEM189, mientras que los plasmalógenos posiblemente contribuyeron al transporte de proteínas ancladas a GPI desde el ER al Golgi. En el modelo invertebrado C. elegans, TMEM189 se localizó en la pared intestinal y dos posibles neuronas sensoriales, indicando un papel sensorial para los plasmalógenos, que no parecen tener una función antioxidante en C. elegans. En el modelo vertebrado pez cebra, la deficiencia de plasmalógenos retrasó el desarrollo, aumentó la inflamación basal y desencadenó la apoptosis de células mieloides. El segundo objetivo surgió de observar que FAD4, el homólogo vegetal de CarF, requiere una peroxirredoxina para su actividad. Por tanto, comprobamos si AhpC, la única peroxirredoxina conservada en M. xanthus y humanos, afecta a la actividad de CarF, y si participa en la respuesta al estrés inducido por peróxidos en la bacteria. La deleción de ahpC no afectó a la biosíntesis de plasmalógenos, pero produjo efectos pleiotrópicos, incluyendo defectos en crecimiento y siembra, y una mayor tolerancia a H2O2. Los análisis transcriptómicos revelaron la regulación positiva de la catalasa KatB, alteraciones en la homeostasis de hierro y azufre y en los sistemas de reparación de DNA y proteínas. Solo la complementación con ahpC bajo el control de su propio promotor restauró el fenotipo silvestre, mientras que los defectos de siembra fueron contrarrestados por piruvato sódico, que neutraliza específicamente H2O2. Puesto que M. xanthus carece de OxyR, que normalmente regula la expresión de catalasas y ahpC en bacterias Gram negativas, nos propusimos hallar qué factor induce katB en células deficientes en ahpC. Esto condujo al descubrimiento de PexR (peroxide regulation), que determina una proteína de tipo bEBP (bacterial enhancer-binding protein) que activa la expresión de promotores dependientes de σ54. En condiciones de estrés oxidativo, PexR activó la expresión de katB y ahpC al unirse a repeticiones (pseudo)palindrómicas aguas arriba de sus promotores dependientes de σ54. Sin embargo, PexR reprimió parcialmente la expresión de ahpC dependiente de σ70 bajo condiciones normales de crecimiento. Curiosamente, la eliminación conjunta de ahpC y katB o pexR resultó en letalidad sintética, resaltando el papel crucial de la inducción de katB mediada por PexR para la viabilidad de células deficientes en AhpC. La eliminación del dominio sensor GAF de PexR generó una forma constitutivamente activa (PexR∆GAF), contrarrestada por la expresión del dominio GAF en trans, lo que sugiere un rol inhibitorio para este dominio. Mutaciones en residuos conservados, que potencialmente forman un centro de hierro no hemo, también favorecieron cierta actividad constitutiva. Análisis transcriptómicos y de interacción proteína-DNA con PexR y PexR∆GAF purificadas mostraron que la acción reguladora de PexR se limita a katB y ahpC. En resumen, este trabajo revela un mecanismo novedoso de regulación de la respuesta al estrés por peróxido en bacterias, crucial para la supervivencia de M. xanthus.

The transmembrane protein CarF is a key player that acts early in the complex response to photooxidative stress of the Gram-negative soil bacterium Myxococcus xanthus. Recent findings revealed that CarF is required in the M. xanthus light response because it corresponds to plasmanylethanolamine desaturase (PEDS1), the enzyme that generates the vinyl-ether bond in plasmalogens (special glycerophospholipids that signal photooxidative stress in M. xanthus). The first objective has been to demonstrate that the animal CarF sequence homologs, known as TMEM189, correspond to the long-sought mammalian PEDS1, and to explore the role of these lipids in human cell lines and in two animal models. Human TMEM189-knockout cells showed a complete depletion of plasmalogens with a concomitant accumulation of their precursors and of the minor signaling species C14-Cer and C14-CerP, thus confirming TMEM189 as the exclusive PEDS in humans. Additionally, the EGFP-TMEM189 fusion protein localized to the endoplasmic reticulum (ER) and complemented the lack of TMEM189, while plasmalogens potentially contributed to GPI-anchored protein transport from the ER to the Golgi. In the invertebrate model C. elegans, TMEM189 localized at the intestinal wall and at two potential sensory neurons, suggestive of a sensory role for plasmalogens, which do not appear to have an antioxidant role in C. elegans. In the vertebrate model zebrafish, plasmalogen deficiency delayed development, increased basal inflammation, and triggered myeloid cell apoptosis. The second objective was inspired by the observation that FAD4, the plant CarF homolog, requires a peroxiredoxin (Prx) for activity. Thus, we tested whether AhpC, the only Prx conserved in both M. xanthus and humans, affects CarF activity, and whether it participates in the peroxide stress response in M. xanthus. The highly conserved and widespread AhpC generally scavenges low H2O2 levels, while catalases detoxify high levels of extracellular H2O2. Interestingly, ahpC deletion did not impair plasmalogen biosynthesis but produced pleiotropic effects, including growth and plating defects and enhanced tolerance to H2O2. Transcriptomic analyses revealed upregulation of the KatB catalase, as well as alterations in iron and sulfur homeostasis, and in DNA and protein repair systems. Only complementation with ahpC under the control of its own promoter restored the wild-type phenotype, while plating defects were counteracted by sodium pyruvate, a H2O2 scavenger. Since M. xanthus lacks the peroxide sensor OxyR, which generally controls kat and ahpC expression in Gram-negative bacteria, we aimed to identify the factor behind katB upregulation in ahpC-deficient cells. This led us to discover PexR (peroxide regulation), a bacterial enhancer-binding protein encoded by the gene immediately upstream of ahpC, that controls the peroxide stress response in M. xanthus. PexR is a member of a class of AAA+ ATPase DNA-binding proteins involved in activating σ54-dependent promoters. While, under peroxide stress, PexR activated katB and ahpC expression by binding to (pseudo)palindromic repeats upstream of their σ54-dependent promoters, PexR partially repressed the σ70-dependent expression of ahpC under normal growth conditions. Interestingly, deletion of ahpC was synthetic lethal with that of katB or pexR, highlighting the crucial role of PexR-mediated katB upregulation for viability of ahpC-deficient cells. Removal of the sensory GAF domain in PexR produced a constitutively active form (PexR∆GAF) that could be countered by expressing the GAF domain in trans, suggesting an inhibitory role for this domain. Additionally, mutations in conserved residues that potentially form a non-heme iron center yielded a partially constitutively active PexR. Transcriptomic and DNA-protein interaction analyses with purified PexR and PexR∆GAF showed that the regulatory action of PexR is restricted to katB and ahpC. Overall, this work reveals a novel mechanism for regulating the peroxide stress response in bacteria, which plays a crucial role for M. xanthus cell survival.