Regulación del inflamasoma NLRP3 en enfermedades autoinflamatorias y su implicaciónen el metabolismo

Abstract

El sistema inmunitario innato es la primera barrera de defensa del organismo y se compone por un gran número de células que contienen receptores capaces de reconocer gran variedad de señales de peligro. Dentro de esos receptores, cabe destacar el papel del receptor intracelular NLRP3, el cual forma un complejo llamado inflamasoma, junto a las proteínas ASC y caspasa-1, que es esencial para la respuesta inflamatoria. Este inflamasoma es el más caracterizado hasta la fecha debido a la gran variedad de señales que puede reconocer y su implicación en el desarrollo de numerosas patologías, siendo una de ellas el síndrome periódico asociado a criopirina (CAPS). Este síndrome, es una enfermedad autoinflamatoria rara que surge por mutaciones de ganancia de función en el gen NLRP3, lo que conlleva a una activación del inflamasoma NLRP3 desmedida y a la sobreproducción de citoquinas proinflamatorias como la IL-1β. Los pacientes con este síndrome sufren episodios inflamatorios esporádicos estériles, y carecen de terapias efectivas, las cuales se centran en bloqueantes de IL-1. A menudo este inflamasoma se presenta como un inflamasoma hipersensible, sin embargo, el mecanismo de activación y regulación del NLRP3 mutante no está del todo descrito. Por otro lado, estudios recientes describen la importancia del metabolismo sobre la respuestas inmunitarias, de hecho, numerosos estudios muestran la relevancia de la ruta de la glicolisis para el correcto desarrollo de la inflamación, sin embargo, como pueden afectar las variantes patogénicas de NLRP3 asociadas a CAPS al metabolismo, no está descrito. Como objetivo principal, esta Tesis pretende elucidar el mecanismo de activación del inflamasoma NLRP3 con variantes patogénicas asociadas a CAPS y como este afecta al metabolismo. Además, se pretende descubrir tratamientos para el síndrome CAPS, determinado así el efecto de 4-octilitaconato e identificando nuevos inhibidores de NLRP3. En esta Tesis se ha evaluado la activación del inflamasoma NLRP3 con variantes asociadas a CAPS en muestras de pacientes y en macrófagos inmortalizados de ratón que expresan mediante un sistema inducible por doxiciclina NLRP3 silvestre y distintas variantes patogénicas (p.R260W, p.D303N, p.T348M). Estas muestras se han utilizado en numerosas técnicas, en las que se incluye la citometría de flujo, ELISA, Western blot, microscopía, y análisis transcriptómico y metabolómico, entre otros. Los resultados de esta Tesis revelan que las variantes patogénicas de NLRP3 asociadas a CAPS inducen una activación constitutiva del inflamasoma, originando una activación de caspasa-1, procesamiento de gasdermina, liberación de IL-18 y piroptosis. Además, se observa que tanto la inducción de NF-kB como las deubiquitinasas están implicadas en su regulación. Por otro lado, se ha descrito que la expresión de variantes patogénicas de NLRP3, produce una reprogramación metabólica que afecta a la glicólisis, disminuyendo la producción de IL-1β. Esta Tesis también se ha centrado en la búsqueda de nuevos posibles tratamientos, observándose que el empleo de 4-octilitaconato inhibía la activación constitutiva de NLRP3 con variantes patogénicas, bloqueando así la formación del complejo NLRP3-ASC. Además, se hizo un cribado de 26 moléculas que se seleccionaron computacionalmente como posibles inhibidores de NLRP3, de esas moléculas se detectó que E1 y E3, eran capaces de inhibir al inflamasoma NLRP3 silvestre y con variantes patogénicas asociadas a CAPS. Como conclusión cabe destacar que en esta Tesis se describe en gran medida el mecanismo de activación del inflamasoma NLRP3 mutante, observándose que las variantes patogénicas de NLRP3 asociadas a CAPS presentan una activación constitutiva del inflamasoma produciendo una reprogramación metabólica que afecta a la glicólisis, lo que arroja nueva luz sobre el posible desarrollo de nuevas terapias más efectivas.

The innate immune system is the body's first defense barrier and is made up of many cells that contain receptors capable of recognizing a wide variety of danger signals. Within these receptors, it is worth highlighting the role of the intracellular receptor NLRP3, which forms a complex called inflammasome, together with the proteins ASC and caspase-1, which is essential for the inflammatory response. This inflammasome is the most characterized to date due to the wide variety of signals it can recognize and its involvement in the development of numerous pathologies, one of them being cryopyrin-associated periodic syndrome (CAPS). This syndrome is a rare autoinflammatory disease that arises from gain-of-function mutations in the NLRP3 gene, which leads to excessive activation of the NLRP3 inflammasome and overproduction of proinflammatory cytokines such as IL-1β. Patients with this syndrome suffer sporadic sterile inflammatory episodes, and lack effective therapies, which focus on IL-1 blockers. This inflammasome often presents as a hypersensitive inflammasome; however, the mechanism of activation and regulation of mutant NLRP3 is not fully described. On the other hand, recent studies describe the importance of metabolism on immune responses, in fact, numerous studies show the relevance of the glycolysis pathway for the correct development of inflammation, however, how the associated pathogenic NLRP3 variants can affect to CAPS to metabolism, is not described. As a main objective, this Thesis aims to elucidate the mechanism of activation of the NLRP3 inflammasome with pathogenic variants associated with CAPS and how this affects metabolism. In addition, the aim is to discover treatments for CAPS syndrome, thus determining the effect of 4-octylitaconate and identifying new NLRP3 inhibitors. In this Thesis, the activation of the NLRP3 inflammasome with variants associated with CAPS has been evaluated in patient samples and in immortalized mouse macrophages that express, through a doxycycline-inducible system, wild-type NLRP3 and different pathogenic variants (p.R260W, p.D303N, p .T348M). These samples have been used in numerous techniques, including flow cytometry, ELISA, Western blot, microscopy, and transcriptomic and metabolomic analysis, among others. The results of this Thesis reveal that the pathogenic variants of NLRP3 associated with CAPS induce a constitutive activation of the inflammasome, causing caspase1 activation, gasdermin processing, IL-18 release and pyroptosis. Furthermore, it is observed that both the induction of NF-kB and deubiquitinases are involved in its regulation. On the other hand, it has been described that the expression of pathogenic variants of NLRP3 produces metabolic reprogramming that affects glycolysis, decreasing the production of IL-1β. This Thesis has also focused on the search for new possible treatments, observing that the use of 4-octylitaconate inhibited the constitutive activation of NLRP3 with pathogenic variants, thus blocking the formation of the NLRP3-ASC complex. In addition, a screening was carried out on 26 molecules that were computationally selected as possible inhibitors of NLRP3. Of these molecules, it was detected that E1 and E3 were capable of inhibiting the wild-type NLRP3 inflammasome and with pathogenic variants associated with CAPS. In conclusion, it should be noted that this Thesis describes to a large extent the mechanism of activation of the mutant NLRP3 inflammasome, observing that the pathogenic variants of NLRP3 associated with CAPS present a constitutive activation of the inflammasome, producing metabolic reprogramming that affects glycolysis, which sheds new light on the possible development of new, more effective therapies.