Caracterización in vitro de células madre/estromales mesenquimales adiposas caninas modificadas mediante exofucosilación enzimática

Abstract

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO: Las células madre/estromales mesenquimales (MSC) son una población de células indiferenciadas con capacidad de autorrenovación y diferenciación a células de distintos linajes mesodérmicos. Su identificación y utilización terapéutica está generando grandes expectativas tanto en medicina humana como veterinaria gracias a su capacidad para secretar moléculas antinflamatorias e inmunomoduladoras, así como otras señales bioquímicas que estimulan la regeneración celular y reparación de los tejidos dañados. En estudios previos se ha comprobado que estos efectos tróficos beneficiosos se encuentran estrechamente relacionados con su capacidad de migración y extravasación hacia los tejidos inflamados. En estos tejidos, se expresan altos niveles de E-selectina, cuya expresión está regulada por citoquinas proinflamatorias como la IL-1 o el TFN-α. Sin embargo, las MSC carecen de la expresión de ligandos para E-selectina como CLA (glicoforma sialofucosilada de PSGL-1) o HCELL (glicoforma sialofucosilada del receptor CD44), lo cual limita su capacidad de migración a los tejidos dañados y afectando por tanto a su eficacia terapéutica tras su administración intravenosa. No obstante, se están desarrollando distintas estrategias para mejorar la capacidad de migración in vivo de las MSC hacia estos tejidos, siendo una de ellas la glicoingeniería de la superficie celular donde destaca la exofucosilación enzimática. Esta técnica consiste en la modificación transitoria del receptor CD44 presente en las MSC, que por medio de un proceso enzimático es transformado en la molécula HCELL que es el ligando más potente de E-Selectina. El objetivo principal de este estudio consistió en determinar si era posible fucosilar de forma efectiva las MSC derivadas del tejido adiposo (AT-MSC) caninas, y si este proceso de exofucosilación enzimática provoca alguna alteración en sus propiedades y/o características celulares y funcionales, evaluando además su preservación en condiciones de refrigeración con vistas a un posible uso terapéutico en la práctica clínica veterinaria. MATERIALES Y MÉTODOS: Las AT-MSC fueron aisladas a partir de lipoexplantes de grasa procedentes de perros donantes (n=10). Para ello, una vez en el laboratorio los lipoexplantes fueron sometidos a una digestión mecánico-enzimática, obteniéndose el cultivo primario y los siguientes subcultivos hasta llegar a pase 2-4, momento en el que fueron sometidas a la exofucosilación enzimática para la realización de los experimentos planificados: 1) Verificación del proceso de exofucosilación enzimática de las AT-MSC caninas; 2) Determinación de la estabilidad de la exofucosilación enzimática en las AT-MSC FUC en condiciones de cultivo (37ºC) y en refrigeración RESUMEN - 267 - (4ºC); 3) Caracterización celular de las AT-MSC FUC en función de su morfología celular, inmunofenotipo y capacidad de diferenciación multipotencial hacia células del tejido adiposo, óseo y cartilaginoso; 4) Caracterización funcional de las AT-MSC FUC determinando su capacidad de proliferación, de migración, de secreción y de inmunomodulación celular; y 5) Estudio de la viabilidad celular en condiciones de refrigeración (4ºC) de las AT-MSC caninas tras su fucosilación. Los datos fueron recopilados en una base de datos Excel© v.19 y analizados mediante el software GraphPadPrism© v.8. RESULTADOS: Nuestros resultados mostraron que las AT-MSC caninas pueden ser fucosiladas de forma efectiva (>98%), revirtiéndose este proceso en condiciones de cultivo celular en menos de 72h en condiciones de cultivo celular (6%) pero manteniéndose estable y funcionales en condiciones de refrigeración (4ºC) durante al menos 4 días (>90%). Además, observamos que las AT-MSC FUC mantienen sus características celulares conservando su morfología, inmunofenotipo celular, capacidad de diferenciación multipotencial hacia tejido adiposo, óseo y cartilaginoso, y capacidad de proliferación. Sin embargo, encontramos que la exofucosilación enzimática aumenta 1,7 veces más su capacidad de migración, y que se vuelven más antinflamatorias e inmunomoduladoras, potenciándose estos efectos aún más en presencia de citoquinas proinflamatorias (TNF-α + IFNγ) como las que se expresan en los tejidos inflamados o dañados. Por último, también observamos que la exofucosilación enzimática no afecta de forma significativa a la viabilidad celular de las AT-MSC caninas, pudiendo además mantenerse funcionales mediante refrigeración a 4ºC durante al menos 4 días.y con una viabilidad celular superior al 90%. CONCLUSIONES: A la vista de los resultados obtenidos, podemos concluir que la exofucosilación enzimática es una técnica factible y segura para su aplicación en AT-MSC caninas, ya que no afecta de forma significativa a las características celulares propias de estas células mesenquimales, y que de forma importante potencia su capacidad de migración y sus efectos terapéuticos antinflamatorios e inmunomoduladores, pudiendo emplearse esta modificación celular para optimizar y mejorar las propiedades de las AT-MSC caninas. De este modo en un futuro próximo esta técnica podría ser utilizada en la práctica clínica veterinaria para el tratamiento de diversas patologías de base inflamatoria y/o inmunomediadas.

INTRODUCTION AND OBJECTIVE: Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are a population of undifferentiated cells with the capacity for self-renewal and differentiation into cells of different mesodermal lineages. Their identification and therapeutic use is raising great expectations in both human and veterinary medicine due to their ability to secrete anti-inflammatory and immunomodulatory molecules, as well as other biochemical signals that stimulate cell regeneration and repair of damaged tissues. Previous studies have shown that these beneficial trophic effects are closely linked to their ability to migrate and extravasate into inflamed tissues. These tissues express high levels of E-Selectin, whose expression is regulated by proinflammatory cytokines such as IL-1 or TFN-α. However, MSC lack the expression of E-selectin ligands such as CLA (sialofucosylated glycoform of PSGL-1) or HCELL (sialofucosylated glycoform of the CD44 receptor), which limits their ability to migrate to injured tissues and thus affects their therapeutic efficacy after intravenous administration. Nevertheless, several strategies are being developed to improve the in vivo migration capacity of MSC to these tissues, including cell surface glycoengineering, in which enzymatic exofucosylation stands out. This technique consists of the transient modification of the CD44 receptor present on MSC, which is modified by an enzymatic process and transformed into the HCELL molecule, the most potent ligand for E-Selectin. The main objective of this study was to determine whether it is possible to effectively fucosylate canine adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells (AT-MSC), and whether this enzymatic exofucosylation process causes any alteration in their properties and/or cellular and functional characteristics, also evaluating their preservation under refrigeration conditions with a view to their possible therapeutic use in veterinary clinical practice. MATERIALS AND METHODS: AT-MSC were isolated from adipose lipoexplants of donor dogs (n=10). For this purpose, once in the laboratory the lipoexplants were subjected to enzymatic mechanical digestion to obtain the primary culture and subsequent subcultures until passages 2-4, at which point they were subjected to enzymatic exofucosylation to perform the planned experiments: 1) Verification of the enzymatic exofucosylation process of canine AT-MSC; 2) Determination of the stability of enzymatic exofucosylation in FUC AT-MSC under culture conditions (37°C) and under refrigeration (4°C); 3) Cellular characterization of FUC AT-MSC according to their cell morphology, immunophenotype and multipotent differentiation capacity SUMMARY/ABSTRACT - 269 - towards adipose, bone and cartilage tissue cells; 4) Functional characterization of FUC AT-MSC by determining their proliferation, migration, secretion and cell immunomodulation capacity; and 5) Study of cell viability under refrigeration conditions (4ºC) of canine AT-MSC after fucosylation. Data were compiled in an Excel© v.19 database and analyzed using GraphPadPrism© v.8 software. RESULTS: Our results showed that canine AT-MSC can be effectively fucosylated (>98%), reversing this process under cell culture conditions in less than 72h under cell culture conditions (6%), but remain stable and functional under refrigerated conditions (4°C) for at least 4 days (>90%). Furthermore, we observed that FUC AT-MSC maintained their cellular properties preserving their morphology, cellular immunophenotype, multipotent differentiation capacity towards adipose, bone and cartilage tissues, and proliferation capacity. However, we found that enzymatic exofucosylation increased their migration capacity 1.7-fold, and that they became more anti-inflammatory and immunomodulatory, with these effects being further enhanced in the presence of proinflammatory cytokines (TNF-α + IFNγ), such as those expressed in inflamed or damaged tissues. Finally, we also observed that enzymatic exofucosylation does not significantly affect the cell viability of canine AT-MSC, which can remain functional in refrigeration at 4°C for at least 4 days,. with a cell viability higher than 90%. CONCLUSIONS: In view of the results obtained, we can conclude that enzymatic exofucosylation is a feasible and safe technique for application in canine AT-MSC, since it does not significantly affect the cellular characteristics of these mesenchymal cells and, importantly, improves their migratory capacity and their therapeutic anti-inflammatory and immunomodulatory effects, and can be used to optimize and improve the properties of canine AT-MSC, to be used in the near future in veterinary clinical practice for the treatment of various pathologies with an inflammatory and/or inmunomediated basis.