Implication of the NLRP3, NLRC4 and Pyrin inflammasomes in inflammatory diseases and sepsis

Abstract

Los receptores llamados NLRP3 y NLRC4 y la proteína Pirina están en las células del sistema inmunitario innato. Su activación en los monocitos desencadena la liberación de factores proinflamatorios denominados citoquinas a través de un tipo especial de muerte celular que se conoce como piroptosis. Fallos en la correcta activación de los inflamasomas o mutaciones en los genes que los codifican resultan en un cambio en la estructura de los mismos y en la formación de complejos autoactivos. Esto desemboca en el desarrollo de enfermedades o síndromes autoinflamatorios. La sepsis es una enfermedad con una elevada prevalencia y mortalidad, siendo una de las principales causas de muerte en las unidades de cuidados intensivos de los hospitales. Sin embargo, actualmente no existen indicadores fiables que le indiquen a los médicos al evolución y pronóstico del paciente a tiempos tempranos. Tampoco existe una terapia eficaz dirigida contra los mecanismos fisiopatológicos de la sepsis.

Por ello, uno de los objetivos principales de esta Tesis Doctoral ha sido avanzar en el estudio sobre los mecanismos de regulación de NLRP3 y Pirina en pacientes críticos con sepsis de origen abdominal. Se encontró que el receptor NLRP3 es un nuevo marcador pronóstico que predice la supervivencia de pacientes con sepsis. Además, se ha comparado el patrón de marcadores inflamatorios entre pacientes sépticos de origen intraabdominal y pacientes con COVID-19. Otro objetivo perseguido por esta Tesis Doctoral ha sido determinar la función de las mutaciones patogénicas que afectan a NLRP3, NLRC4 y MEFV en la activación de los inflamasomas. Por último, también se ha analizado la activación de los inflamasomas NLRP3 y Pirina en pacientes con leucemia monocítica crónica y esclerosis múltiple antes y después del tratamiento farmacológico.

A nivel de metodología, en esta Tesis se ha caracterizado la función de los inflamasomas NLRP3, NLRC4 y Pirina en muestras de sangre humana. Concretamente, se recogieron muestras de pacientes con sepsis durante las primeras 24 horas de desarrollo de la sepsis y pacientes controles sometidos a una cirugía abdominal sin desarrollo de sepsis. Asimismo, se han estudiado pacientes portadores de mutaciones asociadas a enfermedades autoinflamatorias. Además, se ha evaluado el uso de terapias inhibitorias de los componentes del inflamasoma NLRP3 en pacientes con esclerosis múltiple recurrente-remitente y pacientes con leucemias mielomonocíticas crónicas. Cada estudio se ha acompañado con el análisis de donantes sanos. De las muestras de sangre completa se obtuvieron las células mononucleares de sangre periférica, que se cultivaron in vitro, y el plasma. Para obtener los resultados de cada uno de los estudios in vitro se emplearon diferentes técnicas, entre las que destacan: técnica ELISA (determinación de citoquinas liberadas por las células estimuladas) y la citometría de flujo (determinación de porcentaje de monocitos con oligómeros de ASC). Además, se generó una batería de vectores portadores de mutaciones patogénicas de NLRP3 y NLRC4. Para el estudio de su funcionalidad, se transfectaron en células HEK293T y se evaluó su expresión, el grado de autoactivación (oligomerización) y la conformación de los inflamasomas mediante electrotransferencia, citometría de flujo y la técnica BRET, respectivamente.

En cuanto al estudio de los inflamasomas NLRP3 y Pirina en los pacientes sépticos de origen intraabdominal: nuestro estudio confirmó los resultados previos de nuestro grupo de investigación en los que se identificó un grupo de pacientes sépticos con una respuesta comprometida del inflamasoma NLRP3, pero no del inflamasoma Pirina. Sin embargo, ningún parámetro analizado, como los marcadores bioquímicos o los parámetros de severidad, permitió identificar este grupo de pacientes inmunocomprometidos. Los pacientes con una actividad comprometida del inflamasoma NLRP3 que sobrevivieron y se recuperaron de la sepsis, mejora-ron la respuesta del inflamasoma al alta hospitalaria, lo que indicó que la inmunosupresión de NLRP3 es un estado transitorio. Por tanto, hemos podido concluir que la supervivencia de los pacientes sépticos de origen intraabdominal a día uno se asocia con un incremento en la activación canónica del inflamasoma NLRP3 en los monocitos estimulados con LPS y ATP. El estudio de la cohorte de pacientes con COVID-19 mostró que las proteínas de fase aguda, procalcitonina y proteína C-reactiva, así como el indicador de desregulación inmune, ferritina, aumentaban acorde al incremento de la gravedad clínica. Además, cuando se evaluó la concentración en plasma de las citoquinas IL-6, IL-1Ra, IL-15 e IL-18 también se encontró un incremento dependiente de la severidad de la infección por COVID-19. Por tanto, nuestros resultados indican que la señalización mediada por IL-1 y de las citoquinas mediadas por ésta favorecen la respuesta inmunitaria frente a las infecciones bacterianas como la sepsis. Además, durante el desarrollo de esta Tesis se tuvo acceso a muestras de sangre de doce pacientes con EMRR en tratamiento con fingolimod. Tras evaluar la activación del inflamasoma NLRP3 en dichos pacientes, se observó que el tratamiento farmacológico redujo el porcentaje de monocitos con oligómeros de ASC en los pacientes respondedores a los seis meses de tratamiento. Sin embargo, en pacientes no respondedores, no sólo se encontró un aumento en el número de células con oligómeros de ASC, sino también un incremento de muerte celular por piroptosis. Además, en los sobrenadantes de las células mononucleares de sangre periférica sin estimular de los pacientes no respondedores se observó un aumento en la producción de TNF-α e IL-6 tras seis meses de tratamiento. En el caso de los pacientes respondedores, el nivel secretado de estas citoquinas fue incluso menor. Estos resultados sugieren que el tratamiento farmacológico con fingolimod no sólo inhibe la activación del inflamasoma NLRP3, sino que disminuye la ruta de señalización de NF-κB. Por tanto, la falta de inhibición de la activación del inflamasoma NLRP3 en pacientes con EMRR tratados con fingolimod podría identificar individuos refractarios al trata-miento, emergiendo así NLRP3 como un biomarcador. Por último, en esta Tesis hemos analizado una cohorte de pacientes con LMMC portadores o no de mutaciones en el oncogén KRAS. En los pacientes LMMC KRAS-mut se observó un porcentaje elevado (alrededor del 60%) de monocitos con oligómeros de ASC de forma basal. Además, tras la estimulación del inflamasoma NLRP3 con LPS y ATP no se produjo ningún incremento en la liberación de IL-1β. El inhibidor específico de NLRP3, MCC950, redujo significativamente los niveles de IL-1β secretados, pero no la formación de oligómeros de ASC. También, se observó que la activación basal de NLRP3 no estaba asociada a un aumento de muerte por piroptosis. Asimismo, se ha demostrado que el tratamiento con anakinra en un paciente con LMMC y mutación G12D en KRAS, no sólo redujo ex vivo el número de monocitos con oligómeros de ASC, sino también la concentración plasmática de ASC y la liberación de las citoquinas proinflamatorias IL-1β e IL-18. En conjunto, nuestro estudio demostró que los pacientes con LMMC y mutación en KRAS presentan una activación basal de inflamasoma NLRP3. Además, el tratamiento con inhibidores de la ruta de señalización de IL-1 podría considerarse como una opción terapéutica en aquellos pacientes refractarios a las terapias convencionales.

NLRP3 and NLRC4, along with the Pyrin protein, are present on cells of the innate immune system. When activated in monocytes, they trigger the release of pro-inflammatory cytokines through pyroptosis, a specific type of cell death. The incorrect activation of inflammasomes or mutations in the genes that encode them can alter their structure and lead to the formation of autoactivate complexes. Autoinflammatory diseases can develop as a result of this. Sepsis is one of the leading causes of death in hospital intensive care units. However, clinicians currently lack reliable biomarkers to assess the patient's prognosis at an early stage. Additionally, there is no effective therapy targeting the pathophysiological mechanisms of sepsis. So that, one of the main objectives of this Doctoral Thesis has been to characterize the inflammatory markers and the function of the NLRP3 and the Pyrin inflammasomes in septic patients. Moreover, to compare inflammatory markers between septic and COVID-19 patients. Other objectives pursued by this Doctoral Thesis has been to determine the function of NLRP3, NLRC4 and MEFV with pathogenic variants on inflammasome activation and to analyse the activation of the NLRP3 and Pyrin inflammasomes in CMML and MS patients before and after therapeutical treatments. In this Doctoral Thesis, the function of NLRP3, NLRC4, and Pyrin inflammasomes has been characterised in human blood samples. Specifically, blood samples were collected from sepsis patients within the first 24 hours of sepsis onset and from patients undergoing abdominal surgery without sepsis development. Additionally, patients carrying mutations associated with autoinflammatory diseases were studied. In addition, the use of specific NLRP3 inflammasome inhibitors, such as MCC950, has been evaluated in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis and chronic myelomonocytic leukemia. Each study was accompanied by an analysis of healthy donors. Different techniques were used including the ELISA technique (determination of cytokines released by stimulated cells) and flow cytometry (determination of the percentage of monocytes with ASC oligomers). In addition, a battery of vectors carrying pathogenic mutations of NLRP3 and NLRC4 was generated. To study its functionality, HEK293T cells were transfected and its expression, degree of autoactivation (oligomerization), and inflammasome conformation were evaluated using Western Blot analysis, flow cytometry, and BRET technique, respectively. Regarding the study of NLRP3 and Pyrin inflammasomes in intraabdominal origin septic patients of, our study confirmed the previous results of our research group. We identified a group of septic patients with an impaired response of the NLRP3 inflammasome, but not the Pyrin inflammasome. However, none of the parameters analysed, such as biochemical markers, allowed us for the identification of this group of NLRP3 immunocompromised septic patients. Moreover, patients with impaired NLRP3 inflammasome activation who survived and recovered from sepsis improved their NLRP3 inflammasome response upon hospital discharge, indicating that NLRP3 immunosuppression is a transient state. Therefore, we have concluded that the survival of septic patients of intra-abdominal origin at day one is associated with an increase in canonical activation of the NLRP3 inflammasome in monocytes stimulated with LPS and ATP. The study of the COVID-19 patients showed that acute-phase proteins, procalcitonin and C-reactive protein, as well as the immune dysregulation biomarker, ferritin, increased with clinical disease severity. Additionally, plasma concentrations of cytokines IL-6, IL-1Ra, IL-15, and IL-18 were found elevated in most severe COVID-19 patients. Therefore, our findings suggest that IL-1-mediated signalling and its cytokines favour the immune response against bacterial infections such as sepsis. Additionally, during the development of this Doctoral Thesis, blood samples from patients with RRMS undergoing treatment with fingolimod were accessed. The evaluation of NLRP3 inflammasome activation in these patients revealed that fingolimod pharmacological treatment reduced the percentage of monocytes with ASC oligomers in responders after six months of treatment. However, in non-responders’ patients, there was not only an increase in the number of cells with ASC oligomers but also an increase in the pyroptosis cell death. Additionally, after six months of treatment, an increase in the production of TNF-α and IL-6 was observed in the supernatants of unstimulated peripheral blood mononuclear cells from non-responders’ patients. In the case of responder’s patients, the secreted level of these cytokines was even lower. These results suggest that pharmacological treatment with fingolimod not only inhibits the activation of the NLRP3 inflammasome but also decreases the NF-κB signalling pathway. Therefore, the lack of inhibition of NLRP3 inflammasome activation in patients with RRMS treated with fingolimod could identify individual’s refractory to treatment, thus emerging NLRP3 as a biomarker. Finally, this Doctoral Thesis cohort of patients with LMMC with or without mutations in the oncogene KRAS was analysed. In patients with LMMC and KRAS mutation, a high percentage (around 60%) of monocytes with ASC oligomers were observed under basal conditions. Furthermore, no increase in the release of IL-1β was observed after stimulation of the NLRP3 inflammasome with LPS and ATP. The specific NLRP3 inhibitor, MCC950, significantly reduced the levels of secreted IL-1β, but not the formation of ASC oligomers. This basal NLRP3 activation was not associated with an increase in pyroptosis-related death. Furthermore, it has been shown that anakinra treatment in a patient with LMMC and G12D mutation in KRAS not only reduced the number of monocytes with ASC oligomers ex vivo, but also the plasma concentration of ASC and the release of proinflammatory cytokines IL-1β and IL-18. Overall, our study showed that patients with LMMC and KRAS mutation present a basal activation of NLRP3 inflammasome. In addition, treatment with inhibitors of the IL-1 signalling pathway could be considered as a therapeutic option for those patients who are refractory to conventional therapies.