Deciphering the molecular and cellular dynamics of early phagocytosis and granuloma formation in response to Mucorales

Abstract

Las infecciones fúngicas han aumentado en las últimas décadas, principalmente debido al incremento de la población de individuos inmunocomprometidos, lo que se atribuye al uso de tratamientos inmunosupresores y a la prevalencia de enfermedades crónicas como el VIH. El uso de estos tratamientos debilita su sistema inmunológico, haciendo que estos pacientes sean más susceptibles a infecciones por hongos patógenos oportunistas, como el grupo de los Mucorales. Los miembros de este grupo de hongos, clasificados por la Organización Mundial de la Salud como un grupo de alta prioridad, causan una infección potencialmente mortal conocida como mucormicosis, que se caracteriza por altas tasas de mortalidad y tratamientos antifúngicos limitados. En esta tesis, utilizando como organismos modelo Mucor lusitanicus y Rhizopus microsporus, que son dos agentes causales de la mucormicosis, se han descrito los eventos moleculares que operan en la fagocitosis temprana de las esporas de estos hongos y en los granulomas incipientes que se forman cuando el patógeno evade el primer mecanismo de defensa (fagocitosis) y germina formando micelio. Además, se llevó a cabo el estudio de la regulación génica mediada por RNA de interferencia y la predicción de los RNA largos no codificantes (lncRNAs) de estos dos Mucorales y su participación en la interacción patógeno-hospedador. Para caracterizar los granulomas incipientes que se forman en respuesta a esporas germinadas, se desarrolló un protocolo para aislar estos agregados celulares en un modelo de ratón después de 3 horas de infección. La integración de la caracterización molecular de los agregados celulares mediante análisis transcriptómico con su descripción celular mediante análisis de microscopía electrónica y óptica permitió establecer que los neutrófilos son los principales componentes de los granulomas incipientes. Por otro lado, se describieron las redes de genes fúngicos que se activan en las interacciones patógeno-hospedador, ya sea en la fagocitosis de las esporas por los macrófagos o en los granulomas incipientes, determinando que los factores de transcripción BRCA1 y HMG-BOX, las proteínas relacionadas con la cromatina; Histona 1 y Desacetilasa de histonas 1 (HDA1), y una glutamato sintasa son necesarias para la virulencia total de R. microsporus. Curiosamente, BRCA1 y la Histona1 también parecen participar en la virulencia de M. lusitanicus, constituyendo factores de virulencia comunes a ambos Mucorales. Además, se evaluó la regulación génica mediada por el mecanismo de degradación de ARN de interferencia que está implicado en virulencia y que se conoce como Non-Canonical RNA Interference Pathway (NCRIP), porque utiliza la ribonucleasa III atípica R3B2 en M. lusitanicus. La secuenciación simultánea de ARN pequeños y ARN mensajeros de las estirpes silvestre y mutante en r3b2 en condiciones saprofitas y durante su interacción con macrófagos, y el análisis de su perfil transcriptómico permitió identificar las dianas directas del NCRIP. La mayoría de los genes diana identificados son transposones. Entre las dianas directas se incluyen transposones tipo LTR, que se han descrito por primera vez en el genoma de M. lusitanicus en este trabajo. Interesantemente, utilizando dos marcadores del NCRIP, se generaron cepas bioluminiscentes que contienen la fusión de estos marcadores con el gen de la luciferasa para poder estudiar, de forma rápida y sencilla, la regulación del NCRIP. Para tener una comprensión más completa de la regulación génica en el patógeno durante su fagocitosis y durante la formación del granuloma incipiente, se describieron los lncRNAs de R. microsporus y M. lusitanicus. Este análisis permitió identificar cientos de lncRNAs intergénicos, algunos se expresan de forma la interacción patógeno-hospedador. La disrupción de cuatro lncRNA implicados en la infección in vivo de ratones por R. permitió el descubrimiento de dos lncRNA esenciales para la supervivencia del patógeno: lncRNA2 y lncRNA4. Finalmente, tanto los genes codificantes de proteínas descritos como factores de virulencia, como los lncRNAs 2 y 4 constituyen nuevas dianas para el diseño de nuevos tratamientos antifúngicos que bloqueen el crecimiento y la diseminación de hongos y son buenos candidatos como marcadores moleculares de la infección por mucormicosis.

Invasive fungal infections have emerged in the last decades, primarily due to the increasing population of immunocompromised individuals, which is attributed to the use of immunosuppressive treatments, and to the prevalence of chronic diseases such as HIV. The use of these treatments impairs their immune system, making these patientsmore susceptible to opportunistic fungal pathogens, such as the group of Mucorales. Mucorales members, classified by the Word Health Organization as a high-priority group, cause the life-threatening infection known as mucormycosis, which is characterized by high mortality rates and limited antifungal treatments. The immune response to Mucorales and overall, to fungal pathogens is complex and requires multiple cellular and molecular events. On the other hand, fungal pathogens have evolved several mechanisms to evade the immune response. Here, using asmodel organismsMucorlusitanicus and Rhizopusmicrosporus, which are two causal agents of mucormycosis, we have elucidated the molecular events that operate in the early phagocytosisof fungal sporangiospores and in the incipient granulomasformed when the fungal pathogen evades the first mechanism of defense (phagocytosis) and germinates constituting hyphal structures. Additionally, the gene regulation mediated by RNA interference and predicting the fungal lncRNAs and their involvement in the host-pathogen interface were conducted. To characterize the incipient granulomas formed in response to germinated fungal spores, a protocol was developed to isolate these cell aggregates in a mouse model within 3h post-infection. The integration of the molecular characterization of the cell clusters together by transcriptomic analysis with their cellular description by electron and optic microscopy analysis elucidated that neutrophils are the main components of the incipient granulomas. On the other hand, the fungal gene networks that are activated in the host-pathogen interactions, either in the internalization of fungal spores by macrophages or in the incipient granulomas, were elucidated determining that the transcription factors BRCA1 and HMG-BOX, the chromatin related proteins Histone 1 and the histone deacetylase 1 (HDA1), and a glutamate synthase are necessary for the full virulence of R. microsporus. Interestingly, the BRCA1 and Histone1 also seem to participate in M. lusitanicus virulence, constituting common virulence factors. Furthermore, the gene regulation mediated by therelated-virulence RNA degradation mechanism knownas Non-canonical RNA interference pathway (NCRIP) because it uses the atypical ribonuclease III R3B2inM. lusitanicuswas also assessed.The simultaneous sequencingofsmall RNAs and messenger RNAs from a wild-type and ther3b2-mutant strains in saprophytic conditions and with macrophages, and analysing their transcriptomic profileenabled the discovery and description ofthe direct targets of the NCRIP. Most of the identified target genes are transposable elements. Interestingly, these reporters include LTR transposons, which are newly described in the M. lusitanicus genome within this work. Interestingly, using the NCRIP markers, thus the HNH endonuclease and an LTR-transposon, reporter bioluminescent strains containing the fusion of these markersto the luciferasegene were generated to quickly analyse the regulation of the NCRIP. Finally, to have a more comprehensive understanding of gene regulation in the fungal pathogen during phagocytosis and in the incipient granuloma formation, a deep screening of lncRNAs in R.microsporusand M.lusitanicuswas performed. Thisanalysis identified hundreds of intergenic lncRNAs. The differential expression analysis shows that some of the predicted lncRNAs may be involved in the interaction with immune cellsin vitro and in vivo during mice infection. Mouse RNA-seq data analysis revealedthat host lncRNAs are also involved in the response to fungal infection. The disruption of four lncRNAs that are involved in mice in vivo infection by R. microsporus and where incipient granulomas are formed enabled the discovery of two essential lncRNAs: lncRNA2 and lncRNA4. Finally, both protein-coding genes described as virulence factors and lncRNAs 2 and 4 constitute new direct targets to design novel antifungal treatments and block fungal growth and dissemination, and molecular markers of the mucormycosis infection.