Exploring association of melanoma-specific Bcl-xL with tumor immune microenvironment

Abstract

El melanoma representa la forma más mortal de cáncer de piel. Las características del melanoma son su escasa capacidad de respuesta a la quimioterapia estándar y su alta agresividad. Los mecanismos moleculares que conducen al desarrollo y progresión del melanoma son el foco de una intensa investigación, destinada a comprender su patobiología y desarrollar nuevas estrategias de tratamiento. Se han identificado varias mutaciones conductoras y las mutaciones más comunes afectan la señalización de las vías de la proteína quinasa activada por Ras/Raf/mitógenos. Además, la red familiar Bcl-2 se encuentra desregulada en el melanoma. Entre las proteínas de la familia Bcl-2, el linfoma de células B extra Large (Bcl-xL) ha surgido como un factor multifacético que actúa no solo como un factor antiapoptótico canónico, sino también como un promotor de la progresión tumoral. En melanoma se ha encontrado que Bcl-Xl está desregulado. En los últimos años se ha establecido la importancia del microambiente para la progresión tumoral y la respuesta a la terapia, subrayándose la importancia de una comunicación cruzada continua entre las células tumorales y el microambiente, a través de la secreción de mediadores tumorigénicos. En este escenario, los macrófagos asociados a tumores (TAM) desempeñan un papel fundamental que afecta la naturaleza del microambiente tumoral. La infiltración de TAM se correlaciona directamente con el grosor del melanoma y con el aumento de la angiogénesis y la densidad de microvasos, a través de la modulación de los factores proinflamatorios del tumor. Además, el elevado número de TAM en el microambiente tumoral a menudo se correlaciona con un mal pronóstico en el melanoma. Por tanto, los macrófagos representan objetivos terapéuticos prometedores y su agotamiento puede representar una intervención terapéutica eficaz en el tratamiento del melanoma primario y metastásico. Los macrófagos se pueden clasificar en “macrófagos activados clásicamente” o M1, y “macrófagos activados alternativamente” o M2. Los TAM muestran un fenotipo similar a M2 y están estrechamente asociados con células malignas para la migración/invasión, angiogénesis, supresión inmune, formación de metástasis y resistencia a los medicamentos. Para demostrar el efecto inducido por la sobreexpresión de Bcl-xL en la regulación del microambiente tumoral de las células de melanoma humano que silencian o sobreexpresan la proteína Bcl-xL, en este estudio se utilizaron células monocíticas THP-1 y macrófagos derivados de monocitos. Se utilizaron matrices de proteínas y anticuerpos neutralizantes específicos para analizar las citocinas y quimiocinas secretadas por las células de melanoma. Se utilizaron análisis qRT-PCR, ELISA y Western Blot para evaluar los marcadores de polarización de macrófagos y los niveles de expresión de proteínas. Se utilizaron cámaras Transwell para evaluar la migración de THP-1 y macrófagos derivados de monocitos. Se utilizaron modelos de ratón y pez cebra para evaluar la capacidad de las células de melanoma para reclutar y polarizar macrófagos in vivo. Demostramos que las células de melanoma que sobreexpresan Bcl-xL reclutan macrófagos en el sitio del tumor e inducen un fenotipo M2. Además, identificamos que las citocinas interleucina-8 e interleucina-1β están involucradas en la polarización de los macrófagos, y la quimiocina CCL5/RANTES en el reclutamiento de los macrófagos en el sitio del tumor. También encontramos que todos estos factores inducidos por Bcl-xL están regulados de manera dependiente de NF-kB en modelos de melanoma humano y de pez cebra. Nuestros hallazgos confirmaron la función protumoral de Bcl-xL en el melanoma a través de sus efectos sobre los macrófagos, lo que demuestra la capacidad de Bcl-xL para regular la polarización y el reclutamiento de los macrófagos mediante la secreción de factores específicos, estableciendo condiciones microambientales del tumor que favorecen el desarrollo del melanoma.

Melanoma represents the deadliest form of skin cancer. Features of melanoma are the poorly responsiveness and to standard chemotherapeutics and the high aggressiveness. Molecular mechanisms leading to melanoma development and progression are the focus of intense investigation, aimed at understanding its pathobiology and at developing new treatment strategies. A number of driver mutations have been identified and the most common mutations affect signaling of the Ras/Raf/mitogen- activated protein kinase pathways. In addition, the Bcl-2 family network is found deregulated in melanoma. Among Bcl-2 family proteins, B-cell lymphoma-extra Large (Bcl-xL) has emerged as multifaceted factor acting not only as a canonical anti-apoptotic factor, but also as a promoter of tumor progression. In melanoma Bcl-Xl has been found deregulated. In the last years, the importance of the microenvironment for the tumor progression and response to therapy was established, underlying the importance of a continuous crosstalk between tumor cells and microenvironment, through secretion of tumorigenic mediators. In this scenario, tumor-associated macrophages (TAM) play a pivotal role affecting the nature of the tumor microenvironment. TAM infiltration is directly correlated to melanoma thickness and to increased angiogenesis and micro- vessel density, through modulation of tumor pro-inflammatory factors. Moreover, elevated number of TAMs in the tumor microenvironment is often correlated with poor prognosis in melanoma. Thus, macrophages represent promising therapeutic targets, and their depletion can represent an effective therapeutic intervention in the management of primary and metastatic melanoma. Macrophages can be classified in “classically activated macrophages” or M1, and “alternatively activated macrophages” or M2. TAM display an M2-like phenotype and are closely associated partners of malignant cells for migration/invasion, angiogenesis, immune suppression, metastasis formation and drug resistance. To prove the effect induced by the overexpression of Bcl-xL in the regulation of the tumor microenvironment human melanoma cells silencing or overexpressing Bcl-xL protein, THP-1 monocytic cells and monocyte-derived macrophages were used in this study. Protein array and specific neutralizing antibodies were used to analyse cytokines and chemokines secreted by melanoma cells. qRT-PCR, ELISA and Western Blot analyses were used to evaluate macrophage polarization markers and protein expression levels. Transwell chambers were used to evaluate migration of THP-1 and monocyte-derived macrophages. Mouse and zebrafish models were used to evaluate the ability of melanoma cells to recruit and polarize macrophages in vivo. We demonstrated that melanoma cells overexpressing Bcl-xL recruit macrophages at the tumor site and induce a M2 phenotype. In addition, we identified that interleukin-8 and interleukin-1β cytokines are involved in macrophage polarization, and the chemokine CCL5/RANTES in the macrophage’s recruitment at the tumor site. We also found that all these Bcl-xL-induced factors are regulated in a NF-B dependent manner in human and zebrafish melanoma models. Our findings confirmed the pro-tumoral function of Bcl-xL in melanoma through its effects on macrophages demonstrating the ability of Bcl-xL to regulate macrophages polarization and recruitment via the secretion of specific factors, establishing tumor microenvironmental conditions that favour melanoma development.