Interacción funcional entre la maquinaria que regula el crecimiento polarizado, la citocinesis y las rutas de MAP quinasas de estrés e integridad celular

Abstract

La citocinesis, el proceso que permite la separación física de las células una vez ha finalizado la mitosis, consiste en la formación de un anillo contráctil (CAR) formado por filamentos de actina y miosina II, cuya actividad está finamente regulada por la fosforilación de su cadena ligera reguladora (RLC). En las células eucariotas, las vías de señalización por MAPK, desempeñan un papel fundamental durante la respuesta adaptativa a señales ambientales. El correcto ensamblaje y organización de los filamentos de actina depende fundamentalmente de la activación y/o inhibición de diversas vías de señalización, incluyendo las MAPKs. La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe se ha establecido como un excelente organismo modelo para estudiar diversos mecanismos vinculados a las vías de señalización por MAPK y la citocinesis, debido su alto grado de conservación evolutiva. Además, la levadura de fisión dimórfica Schizosaccharomyces japonicus resulta un modelo atractivo para explorar la divergencia evolutiva dentro del género Schizosaccharomyces. S. japonicus presenta otras características, una respiración defectuosa, un citoesqueleto de actina muy dinámico y una mitosis semiabierta. Así, se han posicionado como modelos sencillos pero excepcionales para estudios de biología evolutiva. En base a estos antecedentes, en esta Tesis Doctoral hemos focalizado el estudio de la interacción funcional entre la maquinaria que regula el crecimiento polarizado, la citocinesis y la ruta de MAPK de respuesta a estrés en levaduras con fisión con el fin de analizar la divergencia evolutiva en dos organismos modelo del género Schizosaccharomyces. Para ello, he abordado tres objetivos principales: 1. Estudio de la proteína de unión a ARNm Rnc1 como posible regulador de la actividad de la ruta de MAPKs de respuesta a estrés. 2. Relación funcional entre la actividad de la miosina II por la fosforilación de su cadena ligera reguladora y la disponibilidad de cables de actina en respuesta a cambios en el metabolismo mediado por la actividad de la ruta SAPK. 3. Divergencia evolutiva del control de la citocinesis y el dimorfismo mediado por la actividad de la miosina II por la fosforilación de su cadena ligera reguladora. Para la consecución de los objetivos anteriormente descritos se han empleado tanto cepas silvestres como distintos mutantes de S. pombe y S. japonicus obtenidos mediante manipulación genética o procedentes de otras fuentes (grupos de investigación y colecciones de cepas), así como diferentes técnicas experimentales. Estas incluyen: i- La construcción de cepas mutantes de levadura mediante manipulación genética (deleciones; mutagénesis dirigida; fusiones genómicas) ii- Técnicas de biología molecular (PCR; qPCR) iii- Análisis de proteínas (purificación de proteínas; SDS-PAGE; detección del estado de fosforilación y niveles de proteína mediante Western blot; inmunoprecipitación; ensayos de fosforilación in vivo/in vitro; PhosTag) iv- Técnicas de microscopía (tinción de F-actina y microscopía time-lapse de fluorescencia confocal). Los resultados en su conjunto nos permiten extraer las siguientes conclusiones: - Las proteínas de unión a ARNm constituyen otro punto de apoyo como reguladores para modular la magnitud de la respuesta de la MAPK central de diversas rutas de MAPKs regulando positiva o negativamente la estabilidad de ARNm implicados en la activación o inhibición de la misma. - La citocinesis es un proceso que está altamente influenciado por las condiciones nutricionales. Es por ello que es un proceso perfectamente coordinado y regulado donde la regulación de la actividad de la miosina II por la fosforilación de su RLC resulta crítica para llevar a cabo la citocinesis de manera adecuada. - La divergencia evolutiva en las especies del género Schizosaccharomyces ha tenido como consecuencia el desarrollo de dos mecanismos de control de la citocinesis dependientes e independientes de la fosforilación de la RLC como modulador de la actividad de la miosina II.

Cytokinesis, the process that allows the physical separation of cells after mitosis is complete, involves the formation of a contractile ring (CAR) consisting of actin and myosin II filaments, whose activity is finely regulated by phosphorylation of their regulatory light chain (RLC). In eukaryotic cells, MAPK signalling pathways play a key role during the adaptive response to environmental signals. The correct assembly and organisation of actin filaments depends critically on the activation and/or inhibition of several signalling pathways, including MAPKs. The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has established itself as an excellent model organism to study various mechanisms linked to MAPK signalling pathways and cytokinesis, due to its high degree of evolutionary conservation. In addition, the dimorphic fission yeast Schizosaccharomyces japonicus is an attractive model for exploring evolutionary divergence within the genus Schizosaccharomyces. S. japonicus has the additional features of defective respiration, a highly dynamic actin cytoskeleton and semi-open mitosis. Thus, they have positioned themselves as simple but exceptional models for evolutionary biology studies. Based on this background, in this PhD Thesis we have focused on the study of the functional interaction between the machinery regulating polarised growth, cytokinesis and the MAPK stress response pathway in fission yeast in order to analyse evolutionary divergence in two model organisms of the genus Schizosaccharomyces. To this end, I have addressed three main objectives: 1. Study of the mRNA-binding protein Rnc1 as a possible regulator of the activity of the MAPKs stress response pathway. 2. Functional relationship between the activity of myosin II by phosphorylation of its regulatory light chain and the availability of actin cables in response to changes in metabolism mediated by the activity of the SAPK pathway. 3. Evolutionary divergence of the control of cytokinesis and dimorphism mediated by myosin II activity through phosphorylation of its regulatory light chain. Both wild-type strains and different mutants of S. pombe and S. japonicus obtained by genetic manipulation or from other sources (research groups and strain collections), as well as different experimental techniques, have been used to achieve the objectives described above. These include: i- The construction of yeast mutant strains by genetic manipulation (deletions; targeted mutagenesis; genomic fusions). ii- Molecular biology techniques (PCR; qPCR) iii- Protein analysis (protein purification; SDS-PAGE; detection of phosphorylation status and protein levels by Western blotting; immunoprecipitation; in vivo/in vitro phosphorylation assays; PhosTag) iv- Microscopy techniques (F-actin staining and confocal fluorescence time-lapse microscopy). The results as a whole allow us to draw the following conclusions: - The mRNA-binding proteins constitute another foothold as regulators to modulate the magnitude of the central MAPK response of diverse MAPK pathways by positively or negatively regulating the stability of mRNAs involved in MAPK activation or inhibition. - Cytokinesis is a process that is highly influenced by nutritional conditions. It is therefore a perfectly coordinated and regulated process where the regulation of myosin II activity by phosphorylation of its RLC is critical for cytokinesis to be carried out properly. - Evolutionary divergence in Schizosaccharomyces species has resulted in the development of two cytokinesis control mechanisms dependent and independent of RLC phosphorylation as a modulator of myosin II activity.