Heterogeneidad de las células mesenquimales en la membrana amniótica humana en partos a término

Abstract

Las células mesenquimales (CMa) de la membrana amniótica humana (MAh) presentan características inmunológicas y regenerativas que han suscitado su interés en medicina reparativa. Varias investigaciones han encontrado una cierta heterogeneidad en estas células “in vitro”, sin embargo, no parecen existir caracterizaciones histológicas en la MAh a término "in vivo". Su conocimiento podría encontrar diferencias relacionadas con su viabilidad para el cultivo o su potencial de diferenciación y mejorar la comprensión de los cambios que se producen en las membranas fetales periparto.

Los objetivos de la presente tesis son: Experimento 1: 1) Caracterizar las CMa a nivel morfológico con microscopia de luz (ML) y electrónica de transmisión (MET), en busca de características morfofuncionales que muestren su heterogeneidad y diferencias en la actividad sintética, diferenciación o senescencia, 2) estudiar semicuantitativamente la población de CMa para analizar la frecuencia de los posibles tipos celulares en ML y MET, 3) realizar técnicas inmunohistoquímicas (factores de crecimiento, proteínas de matriz extracelular o citoesqueleto), en las CMa, para poder establecer una relación morfo-funcional. Experimento 2: 4) Revisar la estructura histológica en distintas zonas de las membranas fetales con ML, mediante técnicas convencionales de histología, e histoquímicas, específicas de carbohidratos y fibras de colágeno, 5) cuantificar semicuantitativamente los posibles tipos de CMa en las zonas de la MAh. Realizar posteriormente su análisis estadístico para determinar diferencias zonales, en su frecuencia y número total, 6) identificar inmunohistoquímicamente fibronectina y vimentina en las zonas de las membranas fetales, cuantificándolas mediante western blot y correlacionarlas con la distribución de los tipos de CMa.

En el primer experimento se procesaron 4 porciones periumbilicales de distintas MAh a término, de partos por cesárea, para ML y MET. Sobre las muestras procesadas para ML se realizaron distintas tinciones histoquímicas e inmunohistoquímicas, llevando a cabo un análisis cualitativo de las CMa. En un segundo experimento se analizaron porciones de la zona periumbilical, intermedia y de ruptura de 10 MAh, de partos eutócicos a término que se procesaron para ML realizando diversas tinciones histoquímicas; y también cuantificación de proteínas mediante western blot. La posible heterogeneidad de las CMa se agrupo según criterios morfológicos.

Los resultados mostraron que las CMa presentan una heterogeneidad morfológica encontrado tres tipos celulares (I-III) en ML, distinguiendo, además, las células de Hofbauer en las secciones semifinas. El tipo III mostró el fenotipo más diferenciado y su proporción en la zona de ruptura fue superior a la zona periumbilical. El tipo I, el más indiferenciado, fue más frecuente en esta última (p<0.05). Los tres tipos fueron sucesivamente más intensos a las tinciones de PAS, vimentina, fibronectina, concanavalina-A, VEGF, TGF-β2, PDGF-C y FGF-2. Con MET se identificaron 4 tipos y se observaron dos importantes fenómenos, ambos más intensos en las células tipo 3 y 4: 1) La vesiculación del retículo endoplasmático rugoso (RER) y la exocitosis de su contenido, 2) la dilatación del RER por acumulación de un material, similar a la matriz extracelular, que frecuentemente era liberado. La heterogeneidad de las CMa en las distintas áreas de la MAh guardó relación con la cantidad de fibronectina y vimentina.

En conclusión, la población de CMa es heterogénea y específica en cada zona de la MAh. La heterogeneidad parece secundaria a un proceso de diferenciación fibroblástica que finaliza en senescencia, y que está relacionada con un incremento de la síntesis de factores de crecimientos. Junto a ello, existe un estrés del RER caracterizado por dilatación y acumulación en su interior de fibronectina. Estos cambios en las CMa pueden guardar relación con los fenómenos biofísicos asociados al parto y a la ruptura de la MAh, como también podrían ser de interés para futuros trabajos en medicina regenerativa

Mesenchymal cells (MC) from the human amniotic membrane (hAM) exhibit immunological and regenerative characteristics that have attracted interest in reparative medicine. Several investigations have found a certain heterogeneity in these cells "in vitro", however, histological characterizations of this cells do not seem to exist in hAM at term "in vivo". Their knowledge may find differences related to their viability for culture or their differentiation potential and improve the understanding of the changes that occur in peripartum fetal membranes.

Objectives of the present thesis: Experiment 1: 1) To characterize MC at the morphological level with light microscopy (LM) and transmission electron microscopy (TEM), looking for morphofunctional characteristics that show their heterogeneity and differences in synthetic activity, differentiation or senescence, 2) semi-quantitatively study of MC population to analyze the frequency of possible cell types in LM and TEM, 3) perform immunohistochemical techniques (growth factors, extracellular matrix proteins or cytoskeleton) on the CMa in order to establish a relationship between cell morphology and cell function. Experiment 2: 4) To review the histological structure in different zones of fetal membranes with LM, by means of conventional histological and histochemical techniques, specific for carbohydrates and collagen fibers, 5) to quantify in a semi-quantitatively manner the possible types of MC in the hAM zones. Subsequently perform statistical analysis to determine zonal differences in their frequency and total number, 6) immunohistochemically identification of fibronectin and vimentin in the fetal membrane zones, quantifying them by western blot and correlate them with the distribution of CMa types.

In the first experiment, 4 periumbilical portions of different hAM at term, from cesarean deliveries, were processed for LM and TEM. On the samples processed for LM, different histochemical and immunohistochemical stains were performed, carrying out a qualitative analysis of the MC. In a second experiment, portions of the periumbilical, intermediate and rupture zone of 10 hAM, from eutocic births at term, were analyzed and processed for LM by performing different histochemical stains; and also protein quantification by western blot. The possible heterogeneity of the MC was grouped according to morphological criteria.

The results showed that the MC presented morphological heterogeneity, finding three cell types (I-III) in LM, distinguishing, in addition, the Hofbauer cells in the semithin sections. Type III showed the most differentiated phenotype and its proportion in the rupture zone was higher than in the periumbilical zone. Type I, the most undifferentiated type, was more frequent in the latter (p<0.05). The three types were successively more intense to PAS, vimentin, fibronectin, concanavalin-A, VEGF, TGF-β2, PDGF-C and FGF-2 staining. With TEM, 4 types were identified and two important phenomena were observed, both more intense in type 3 and 4 cells: 1) vesiculation of the rough endoplasmic reticulum (RER) and exocytosis of its contents to extracellular matrix (EM), 2) dilatation of the RER by accumulation of a material, similar to EM, which was frequently released. The heterogeneity of the CMa in the different areas of the hAM was related to the amount of fibronectin and vimentin.

In conclusion, the CMa population is heterogeneous and region specific along the hAM. The heterogeneity seems to be secondary to a fibroblastic differentiation process that ends in senescence, and which is related to an increase in the synthesis of growth factors. In addition, there is a stress of the RER characterized by dilatation and accumulation of fibronectin in its interior. These changes in the MC may be related to the biophysical phenomena associated with parturition and rupture of the fetal membranes, and may also be of interest for future work in regenerative medicine.