Estudio in vivo del efecto sobre la microbiota oral de la aplicación de un barniz de flúor tras la reducción del esmalte interproximal con fines ortodóncicos

Abstract

La reducción del esmalte interproximal (IPR) es una técnica comúnmente aplicada en ortodoncia con el fin de obtener más espacio para alinear los dientes y mantener la alineación a largo plazo. Se ha demostrado que el procedimiento de IPR da lugar a una superficie de esmalte más susceptible a sufrir fenómenos de desmineralización, por lo que, independientemente del método de IPR utilizado, es importante la protección de dicha superficie. Los aparatos fijos de ortodoncia como los brackets crean nuevas zonas retentivas favorables a la acumulación de placa, lo que provoca un cambio en la microbiota oral. Los microorganismos se analizan y clasifican con las técnicas de secuenciación del gen 16S RNA. Dentro del contexto en el que las enfermedades orales son generadas por una disbiosis, nuestro estudio pretende determinar si la aplicación de un aparato de ortodoncia a un paciente, desestabiliza el sistema y genera disbiosis, por ello caracterizaremos la microbiota oral de los pacientes portadores de aparatología fija multibrackets. Por otra parte, la mayoría de los estudios publicados acerca de la microbiota oral no tienen en cuenta que puede haber microorganismos diferentes según la superficie del diente, por lo que nos parece interesante poder estudiar la microbiota que existe en las distintas superficies del esmalte (vestibular -V-, palatina -P- e interproximal -IP-) en individuos. Hasta donde nosotros conocemos no hay estudios en la literatura que evalúen in vivo los cambios en la microbiota oral en pacientes con aparatología fija multibrackets a los que se les realiza IPR y se les aplica un barniz de flúor como medida preventiva, lo cual nos motivó para realizar este trabajo de investigación cuyo objetivo general fue determinar si la microbiota de la superficie interproximal del esmalte en pacientes portadores de aparatos fijos multibrackets se ve afectada por el procedimiento de IPR y la aplicación de un barniz de flúor. Para ello se seleccionaron 20 pacientes candidatos a portar aparatos fijos de ortodoncia a los que se les tomaron muestras de placa de las superficies V, P e IP de los primeros premolares superiores derechos (lado experimental) e izquierdo (lado control). Los pacientes se dividieron en dos grupos (n=10): grupo 1 (sometidos a IPR) y grupo 2 (sometidos a IPR con aplicación de barniz de flúor). La toma de muestras se realizó en un periodo de tiempo de 3 meses con cuatro tiempos diferentes, a saber: T0: se dieron instrucciones de higiene oral a los pacientes y se entregó el dentífrico sin flúor. Se tomaron las muestras de placa. Previamente se les había indicado que no debían cepillarse desde la noche anterior a la toma de muestra. T1: Transcurrido 1 mes desde T0, se tomaron muestras de placa previamente al cementado del aparato en los pacientes. T2: 1 mes después del cementado del aparato, se tomaron muestras de placa. En este tiempo se realizó el procedimiento de IPR a los dos grupos y tras el mismo se aplicó Bifluorid® 12 en el grupo 2. El IPR se realizó entre el primer premolar superior derecho (1.4) y el segundo premolar superior derecho (1.5) con tiras de separación (Horico®, Berlín, Alemania) y fresa de diamante (Komet®). El barniz de flúor Bifluorid® 12 se aplicó tras el procedimiento de IPR en os pacientes del grupo 2 sobre la superficie interproximal de 1.4 y 1.5 siguiendo las instrucciones del fabricante: con las superficies dentarias secas, se aplicó mediante un pincel (Pele Tim®) distribuyéndolo sobre las superficies dejando una capa fina. T3: 2 meses después del cementado del aparato. Se tomaron las últimas muestras y se indicó al paciente que podía continuar utilizando su dentífrico habitual. A todos los pacientes se les realizaron dos mediciones de lactato, una basal y otra pasados 10 minutos. Dichas mediciones se tomaron de la misma muestra. También se realizó una medición del pH. La extracción del ADN de nuestras muestras se realizó en uno de los laboratorios de FISABIO, la Fundación para el Fomento de la Investigación Sanitaria y Biomédica de la Comunidad Valenciana, con el robot MagNA PURE LC DNA Isolation kit II (Roche®). Las lecturas obtenidas tras la secuenciación masiva de la región hipervariable del gen ribosomal 16S fueron analizadas utilizando el programa Dada2. Todo el proceso de comparación y estadística se realizó utilizando R (lenguaje de programación y un entorno para el análisis estadístico y gráfico). El p valor se ajustó utilizando el sistema de tasa de descubrimiento falso (FDR) (p<0.05). La significatividad de las diferencias entre las proporciones de cada taxón, entre los valores de pH y de lactato entre los grupos, se calculó mediante el test de Wilcoxon (p<0.05). Según nuestros resultados, los análisis estadísticos que consideraron todas las bacterias detectadas en las superficies IP, V y P mostraron diferencias significativas entre estos tres nichos. En nuestro estudio, también se apreciaron diferencias entre las bacterias al mes de cementar los brackets, produciéndose un aumento de bacterias asociadas a gingivitis y periodontitis. También aumenta la diversidad bacteriana en IP y P, pero no en la superficie V. El hecho de que en la superficie V haya menos diversidad puede estar relacionado con la higiene. Respecto al IPR, no se observaron diferencias significativas después de realizar dicho procedimiento, parece que la microbiota se estabiliza en el tiempo, aunque es interesante observar que todas las especies que son más abundantes antes del IPR son anaerobias estrictas mientras que las que lo son después del IPR pueden vivir en presencia de oxígeno. La especie que aumentó de forma más significativa tras la aplicación de un barniz de flúor fue Haemophilus parainfluenzae, asociada a salud. Por otra parte, encontramos géneros relacionados con enfermedades bucodentales que disminuyeron de forma significativa tras la aplicación de flúor. Al analizar los cambios en el pH, encontramos que el pH tiende a mejorar. Después de realizar IPR, el pH tiende a empeorar en el grupo 1 (IPR), pero no en el grupo 2 (IPR+F-), se crea, por tanto, un efecto tampón cuando se administra flúor que mantiene el pH. Es un resultado esperado y prometedor aunque las diferencias no son significativas.

Interproximal enamel reduction (IPR) is a technique commonly applied in orthodontics in order to obtain more space to align teeth and maintain long-term alignment. It has been shown that the IPR procedure results in an enamel surface that is more susceptible to demineralization phenomena, therefore, regardless of the IPR method used, it is important to protect that surface. Fixed orthodontic appliances such as brackets create new undercut areas favorable to plaque accumulation, which causes a change in the oral microbiota. Microorganisms are analyzed and classified with 16S RNA gene sequencing techniques. Within the context in which oral diseases are generated by dysbiosis, our study aims to determine if the application of an orthodontic appliance to a patient destabilizes the system and generates dysbiosis, for this reason we will characterize the oral microbiota of patients wearing fixed multi-brackets appliances. On the other hand, most of the published studies on the oral microbiota do not take into account that there may be different microorganisms depending on the surface of the tooth, so we find it interesting to be able to study the microbiota that exists on the different surfaces of the enamel (vestibular -V-, palatal -P- and interproximal -IP-) in individuals. To the best of our knowledge, there are no studies in the literature that evaluate in vivo changes in the oral microbiota in patients with multi-bracket fixed appliances who undergo IPR and fluoride varnish is applied as a preventive measure, which motivated us to to carry out this esearch whose general objective was to determine if the microbiota of the interproximal surface of the enamel in patients wearing multibracket fixed appliances is affected by the IPR procedure and the application of a fluoride varnish. To this end, 20 patients who were candidates for wearing fixed orthodontic appliances were selected from whom plaque samples were taken from the V, P and IP surfaces of the upper right (experimental side) and left (control side) first premolars. The patients were divided into two groups (n=10): group 1 (undergoing IPR) and group 2 (undergoing IPR with fluoride varnish application). The sampling was carried out in a period of 3 months with four different times, namely: T0: Oral hygiene instructions were given to patients and fluoride-free toothpaste was given. Plaque samples were taken. They had previously been told that they should not brush from the night before the sample was taken. T1: 1 month after T0, plaque samples were taken prior to the cementation of the appliance in the patients. T2: 1 month after the cementation of the appliance, plaque samples were taken. During this time, the IPR procedure was performed on both groups and after it, Bifluorid® 12 was applied to group 2. The IPR was performed between the first upper right premolar (1.4) and the second upper right premolar (1.5) with separation strips (Horico®, Berlin, Germany) and diamond bur (Komet®). Bifluorid® 12 fluoride varnish was applied after the IPR procedure in group 2 patients on the interproximal surface of 1.4 and 1.5 following the manufacturer's instructions: with the dental surfaces dry, it was applied using a brush (Pele Tim®). distributing it on the surfaces leaving a thin layer. T3: 2 months after the cementation of the appliance. The last samples were taken and the patient was told that he could continue using his usual toothpaste. All patients underwent two lactate measurements, one at baseline and another after 10 minutes. These measurements were taken from the same sample. A pH measurement was also performed. The DNA extraction from our samples was carried out in one of the laboratories of FISABIO, the Foundation for the Promotion of Health and Biomedical Research of the Valencian Community, with the MagNA PURE LC DNA Isolation kit II robot (Roche®). The readings obtained after massive sequencing of the hypervariable region of the 16S ribosomal gene were analyzed using the Dada2 program. The entire comparison and statistical process was performed using R (programming language and an environment for statistical and graphical analysis). The p value was adjusted using the false discovery rate (FDR) system (p<0.05). The significance of the differences between the proportions of each taxon, between the pH and lactate values between the groups, was calculated using the Wilcoxon test (p<0.05). In our study, differences were also observed between bacteria a month after cementing the brackets, producing an increase in bacteria associated with gingivitis and periodontitis. Bacterial diversity also increases in IP and P, but not in the V surface. The fact that there is less diversity in the V surface may be related to hygiene. Regarding the IPR, no significant differences were observed after performing this procedure, it seems that the microbiota stabilizes over time, although it is interesting to observe that all the species that are more abundant before the IPR are strictly anaerobic while those that are after of IPR can live in the presence of oxygen. The species that increased most significantly after the application of a fluoride varnish was Haemophilus parainfluenzae, associated with health. On the other hand, we found genres related to oral diseases that decreased significantly after the application of fluoride. By analyzing changes in pH, we find that pH tends to improve. After performing IPR, the pH tends to worsen in group 1 (IPR), but not in group 2 (IPR+F-), therefore, a buffer effect is created when fluoride is administered that maintains the pH. It is an expected and promising result, although the differences are not significant.