Enfermedad inflamatoria intestinal : herramientas analíticas y metabolómicas para su diagnóstico y valoración del estado nutricional

Abstract

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un trastorno inmunitario crónico y multifactorial caracterizado principalmente por la inflamación del intestino, que cursa con periodos de actividad y remisión disminuyendo la calidad de vida de los pacientes. En general, la EII engloba dos patologías diferentes: la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). Clínicamente, ambas enfermedades comparten síntomas similares, como diarrea sanguinolenta, dolor abdominal, debilidad y pérdida de peso; mientras que suelen diferir en las complicaciones y la prevalencia, así como en la localización y profundidad de la inflamación. Actualmente el diagnóstico de la EII y sus diferentes entidades no es tarea sencilla, y este pasa por la observación de diferentes factores clínicos, histológicos, endoscópicos y analíticos siendo un proceso costoso, invasivo y lento. En este aspecto, los recientes avances en la instrumentación analítica y las estrategias metabolómicas han jugado un importante papel en el estudio de la EII. En esta Tesis Doctoral se ha estudiado el perfil de compuestos orgánicos volálites (VOCs) de pacientes con EII mediante aproximaciones metabolómicas no dirigidas con el objetivo de desarrollar modelos quimiométricos para el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad. Los métodos serán aplicados en el análisis de orina y suero sanguíneo. La orina presenta ventajas como su fácil recogida, siendo una de las principales vías de excreción de metabolitos hidrosolubles y xenobióticos, mientras que el suero sanguíneo proporciona una visión general del metabolismo, aunque con un nivel de especificidad inferior en comparación con la orina. En el Capítulo 1, se desarrollada una metodología basada en cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS) para la monitorización del perfil de VOCs en suero. Además, se propone un análisis de espacio de cabeza (HS) como tratamiento de la muestra y sistema de introducción, evitando los procedimientos más complejos descritos hasta la fecha. El tratamiento quimiométrico consiste en un análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) que permite generar modelos de predicción útiles para la diferenciación entre pacientes con EII e individuos sanos sin EII. En el Capítulo 2, se optimiza y validada un método basado en GC acoplada a la espectrometría de movilidad iónica (IMS) usando también inyección por espacio de cabeza para la determinación de los VOCs tanto en muestras de suero como orina. La IMS es una técnica analítica emergente cuyas aplicaciones en el campo clínico son cada vez más frecuentes debido a sus múltiples ventajas frente a otras técnicas analíticas. La IMS realiza una separación bidimensional ya que los analitos se separan en función de su interacción con la columna GC y de su comportamiento de deriva bajo la influencia de un campo eléctrico, aumentando el poder de resolución y posibilitando la motorización de un mayor número de VOCs. Los VOCs determinados mediante GC-IMS se utilizan para la diferenciación entre pacientes con EII e individuos sanos, así como los diferentes estadios de la enfermedad (enfermedad activa o en remisión) mediante la creación de modelos basados en OPLS-DA. Además, se desarrolla de manera simultánea una estrategia dirigida que permite la cuantificación e identificación de volátiles en muestras biológicas de interés para determinar qué compuestos contribuyen en mayor medida a cada una de las clases de EII. Los métodos desarrollados en ambos Capítulos podrían ser utilizados como una herramienta complementaria en el diagnóstico de la EII, evitando métodos invasivos de alto coste como la endoscopia. Por otro lado, es esta Tesis Doctoral también se estudia y compara la malnutrición y la malabsorción de pacientes con EC o CU con la enfermedad activa o en remisión. Ambos síndromes afectan directamente a los pacientes EII provocando alteraciones en el metabolismo del hierro, en el perfil lipídico y en su estado nutricional. Concretamente en el Capítulo 3 se evalúa el metabolismo del hierro, a través de los valores de hierro sérico, ferritina, índice de saturación de la ferritina, hemoglobina y volumen corpuscular medio. Los niveles de ferritina pueden aumentar en caso de inflamación causando un factor de confusión en los resultados obtenidos, por lo que en este estudio también se han evaluado de manera conjunta los niveles de proteína C reactiva (PCR). Para evaluar el perfil lipídico se investigan los parámetros de colesterol, triglicéridos, LDL y HDL, así como el riesgo aterogénico asociado a la enfermedad mediante el índice de Castelli. Finalmente, se realiza un estudio del estado nutricional a través de la observación microscópica de las heces y el cribado CONUT correlacionándolo con los niveles de calprotectina fecal (CF).

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic, multifactorial immune disorder characterised primarily by inflammation of the intestine, with periods of activity and remission that diminish patients' quality of life. In general, IBD encompasses two different pathologies: ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD). Clinically, both diseases share similar symptoms, such as bloody diarrhoea, abdominal pain, weakness and weight loss; while they often differ in complications and prevalence, as well as in the location and depth of inflammation.

Diagnosis of IBD and its different entities is currently not a simple task, and involves the observation of different clinical, histological, endoscopic and analytical factors and is a costly, invasive and time-consuming process.

In this regard, recent advances in analytical instrumentation and metabolomics strategies have played an important role in the study of IBD. In this PhD thesis, the volatile organic compounds (VOCs) profile of IBD patients has been studied using non-targeted metabolomics approaches with the aim of developing chemometric models for the diagnosis and monitoring of the disease. The methods will be applied to urine and blood serum analysis. Urine has advantages such as easy collection, being one of the main routes of excretion of water-soluble metabolites and xenobiotics, while blood serum provides an overview of metabolism, although with a lower level of specificity compared to urine.

In Chapter 1, a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based methodology for monitoring the VOC profile in serum is developed. In addition, a headspace analysis (HS) is proposed as sample treatment and introduction system, avoiding the more complex procedures described to date. The chemometric treatment consists of an orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) that allows the generation of prediction models useful for the differentiation between IBD patients and healthy individuals without IBD. In Chapter 2, a method based on GC coupled to ion mobility spectrometry (IMS) is optimised and validated using also headspace injection for the determination of VOCs in both serum and urine samples. IMS is an emerging analytical technique whose applications in the clinical field are becoming more and more frequent due to its many advantages over other analytical techniques. IMS performs a two-dimensional separation as analytes are separated according to their interaction with the GC column and their drift behaviour under the influence of an electric field, increasing the resolving power and enabling the motorisation of a larger number of VOCs. The VOCs determined by GC-IMS are used to differentiate between IBD patients and healthy individuals, as well as the different stages of the disease (active disease or in remission) by creating OPLS-DA-based models. In addition, a targeted strategy is simultaneously developed that allows the quantification and identification of volatiles in biological samples of interest to determine which compounds contribute most to which classes of IBD.

The methods developed in both chapters could be used as a complementary tool in the diagnosis of IBD, avoiding high-cost invasive methods such as endoscopy. On the other hand, this PhD Thesis also studies and compares malnutrition and malabsorption in patients with CD or UC with active disease or in remission. Both syndromes directly affect IBD patients causing alterations in iron metabolism, lipid profile and nutritional status.

Specifically, in Chapter 3, iron metabolism is assessed through serum iron, ferritin, ferritin saturation index, haemoglobin and mean corpuscular volume. Ferritin levels may increase in case of inflammation causing a confounding factor in the results obtained, so in this study C-reactive protein (CRP) levels were also assessed together. To evaluate the lipid profile, the parameters of cholesterol, triglycerides, LDL and HDL are investigated, as well as the atherogenic risk associated with the disease using the Castelli index. Finally, a study of nutritional status is performed by microscopic observation of faeces and CONUT screening correlating it with faecal calprotectin (FC) levels.