Factores de origen femenino y masculino relacionados con la fertilidad humana y su aplicación en clínicas de reproducción asistida : proteínas del fluido folicular y genes de compactación del ADN espermático

Abstract

La infertilidad afecta alrededor del 15% de parejas en edad reproductiva. Su prevalencia se considera similar entre países desarrollados y países en vías de desarrollo; no obstante, está en aumento a nivel mundial por diversos factores clínicos y de hábitos sociales como la obesidad, enfermedades de transmisión sexual, e incluso por postergar la edad para concebir. La infertilidad se ha abordado considerando su origen como femenino o masculino, aunque existe un porcentaje importante de casos definidos como idiopáticos, por lo que existe un interés creciente en el diagnóstico adecuado de la pareja infértil.

Dentro del manejo de la infertilidad femenina, muchas mujeres requieren tratamientos de fecundación in vitro (FIV) para lograr un embarazo a término con un niño/a nacido vivo. En una FIV, la recuperación de complejos cúmulus-ovocito (COCs) competentes es importante. Considerando que en esta competencia influye de manera decisiva la contribución de las células del cúmulus y el fluido folicular (FF), el estudio de la composición de este biofluido y su relación con la infertilidad es relevante. De hecho, la oscilación de las concentraciones de proteínas totales del FF podría afectar a la competencia del ovocito; así mismo, los niveles de especies reactivas de nitrógeno (RNS) permitirían evaluar el daño oxidativo de las proteínas presentes en el fluido folicular humano (FFH).

Por otro lado, en la infertilidad masculina, entre el 30 y 72% de los casos aún son diagnosticados como idiopáticos, por lo que se han desarrollado pruebas diagnósticas más completas que permiten evaluar factores moleculares y genéticos como posibles causas de la infertilidad. Sin embargo, estas pruebas no son de uso rutinario en la práctica clínica. Entre las causas genéticas estudiadas en relación con la fertilidad masculina se encuentran los polimorfismos en los genes involucrados en la compactación del ADN: PRM1, PRM2, TNP1 y TNP2. También, la expresión de estos genes (ARN) y el estado de protaminación del ADN son de interés en el estudio de la infertilidad masculina.

Considerando lo expuesto, y tras una exhaustiva revisión bibliográfica expuesta en el capítulo I, este trabajo pretende abordar el estudio de la infertilidad desde su vertiente femenina y masculina para identificar biomarcadores sencillos y no invasivos que puedan ser utilizados como predictivos del éxito de los tratamientos de fertilidad en la clínica rutinaria y, de este modo, mejorar la eficiencia en los ciclos de reproducción asistida.

En el capítulo II se estudió en el FFH, la concentración de proteínas totales (PT), albúmina y globulinas, así como los niveles de proteínas modificadas con nitrotirosina para valorar el grado de estrés oxidativo de este biofluido y su relación con la posterior calidad ovocitaria y embrionaria. Para ello, el FFH de 74 mujeres sometidas a tratamiento de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (41 grupo control y 33 mujeres infértiles con diferentes diagnósticos) fue recuperado tras la aspiración folicular y recuperación de los complejos cúmulus-ovocito (COCs). El FFH se centrifugó, filtró y almacenó a -20ºC hasta su análisis. La concentración de PT, albúmina y globulinas se determinó mediante la plataforma analítica COBAS c501 utilizando el método de fotometría automatizada - test colorimétrico, mientras que la medición del nivel de proteínas modificadas con nitrotirosina se analizó mediante el test ELISA 3-nitrotirosina (3-NT). Los resultados mostraron una distribución homogénea de las concentraciones de PT, albúmina y globulinas en el grupo control, mientras que en el grupo infértil se observó una gran variabilidad en esta distribución entre los diferentes diagnósticos de las pacientes. El grupo control alcanzó mayores concentraciones proteicas que el grupo infértil: PT (4.92±0.09 g/dl vs. 4.45±0.12 g/dl), albúmina (1.84±0.06 g/dl vs. 1.66±0.04 g/dl) y globulinas (3.08±0.05 g/dl vs. 2.79±0.09 g/dl). Las mujeres con endometriosis e insuficiencia ovárica tuvieron menores concentraciones de PT y albúmina que las mujeres con otros diagnósticos de infertilidad. Por otro lado, no se encontró diferencia en las concentraciones de 3-NT entre el grupo control (28.40±1.79 ng/ml) vs. infértiles (26.83±2.20 ng/ml) ni hubo diferencias dentro del grupo de mujeres infértiles en base a sus diagnósticos.

En el capítulo III se estudiaron los polimorfismos en los genes TNP1, TNP2, PRM1 y PRM2 en hombres mestizo ecuatorianos fértiles e infértiles. Para esto se incluyeron 144 hombres (43 control y 101 grupo infértil) a los que se les realizó un espermiograma y una toma de muestra de sangre periférica. Se realizó extracción de ADN en la sangre periférica, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación de estos genes. Se identificaron nueve polimorfismos ninguno de los cuales mostraron relación con la fertilidad y no serían factor de riesgo de infertilidad en el varón. Los polimorfismos identificados fueron rs62180545 en TNP1, rs11640138 y rs56069754 en TNP2, rs201923496 y rs737008 en PRM1, rs749752404, rs1646022, rs2070923 y rs182114260 en PRM2. De este grupo, los únicos polimorfismos no descritos previamente en otras poblaciones fueron rs749752404 y rs182114260, ambos en PRM2.

En el capítulo IV se estudió los niveles de protaminación/empaquetamiento de la cromatina y expresión de PRM1 y PRM2 (ARN) en espermatozoides de hombres fértiles e infértiles. Para ello

se incluyeron 131 individuos (35 grupo control y 96 pacientes infértiles), a los que se les realizó un análisis de semen. La muestra seminal fue sometida a la técnica de selección espermática swim up y dividida en alícuotas en tubos de criopreservación y almacenadas a -196°C hasta su posterior procesamiento. La evaluación indirecta del empaquetamiento de la cromatina en espermatozoides se realizó mediante el ensayo de cromomicina A3 (CMA3), mientras que para la evaluación de la expresión de los genes PRM1 y PRM2, se realizó extracción de ARN, cDNA y PCR en tiempo real con el reactivo Power SYBR® Green PCR Máster Mix. El gen BETA-ACTINA (BA) fue considerado como gen de referencia. En los resultados se observó mayor porcentaje de espermatozoides con CMA3 en el grupo infértil vs. grupo control (15.37±1.00 vs. 12.10 ±1.01, P=0.01). Dentro del grupo control los niveles de CMA3 estuvieron aumentados en individuos con sobrepeso y obesidad tipo I frente al peso normal, llegando estos niveles a ser igual de elevados que los del grupo infértil. También dentro del grupo control, los individuos con varicocele que se sometieron a operación presentaron menores niveles de CMA3 comparados con los individuos no operados. Por otro lado, al evaluar los niveles medios de expresión (ΔCT) de PRM1 y PRM2, así como el ratio PRM1/PRM2, no se encontraron diferencias entre ambos grupos de estudio. Al evaluar la influencia del índice de masa corporal en los resultados, sólo se encontraron diferencias en el ratio PRM1/PRM2 de pacientes infértiles entre individuos con peso normal vs. sobrepeso (P=0.001).

Los resultados de este trabajo sugieren que la concentración de proteínas totales del FFH podría ser considerado como marcador dentro del tratamiento de reproducción asistida; y el análisis del estado de protaminación (CMA3) permitiría una identificación de posible causa de infertilidad en hombres catalogados con infertilidad idiopática.

Infertility affects 15% of couples in reproductive ages, with similar prevalence between developed and developing countries. Fertility prevalence is increasing worldwide due to clinical factors and social habits such as obesity, sexually transmitted diseases, or delayed childbearing. Infertility has been approached considering its origin as female or male, although there is still a significant percentage of cases defined as idiopathic, so there is growing interest in the proper diagnosis of the infertile couple.

Within the management of female infertility, many women require in vitro fertilization (IVF) treatments to achieve a full-term pregnancy with a live-born child. In IVF, the recovery of competent cumulus-oocyte complexes (COCs) is important. Considering that competent COCs are achieved mainly by the contribution of cumulus cells and follicular fluid (FF), the study of the composition of this biofluid is interesting. In fact, the oscillation of the total protein concentrations of the FF could affect the competence of the oocyte; likewise, the reactive nitrogen species (RNS) contained in the FF may allow the evaluation of the oxidative damage of the proteins present in the human follicular fluid (FFH).

On the other hand, in male infertility, between 30 and 72% of the cases are still diagnosed as idiopathic so more complete diagnostic tests, that allow the evaluation of molecular and genetic factors as possible causes of infertility, have been developed. However, these tests are not routinely used in clinical practice. Also, the expression of these genes (RNA) and the state of DNA protamination are of interest in the study of male infertility.

Considering the above, and after a deep literature review exposed in chapter I, this work aims to broach the study of infertility from its female and male aspects to identify simple and non- invasive biomarkers that can be used as predictors of the success of fertility treatments in routine clinics and, in this way, improve efficiency in assisted reproduction cycles.

In chapter II, the concentration of total proteins (TP), albumin and globulins, as well as the levels of nitrotyrosine-modified proteins were studied in FFH to assess the degree of oxidative stress. For this, the FFH of 74 women undergoing ICSI treatment (41 control group and 33 infertile women with different diagnoses) was recovered after follicular aspiration and recovery of the COCs. The FFH was centrifuged, filtered, and stored at -20°C until analysis. The concentration of PT, albumin and globulins was determined by the COBAS c501 analytical platform using the

automated photometry method - colorimetric test, while the measurement of the level of nitrotyrosine-modified proteins was analyzed with the 3-nitrotyrosine (3-NT) ELISA test. The results showed a constant distribution in the concentrations of PT, albumin, and globulins in the control group, while in the infertile group great variability was observed in this distribution between the different diagnoses of the patients. The highest concentrations of PT (4.92±0.09 g/dl vs. 4.45±0.12 g/dl), albumin (1.84±0.06 g/dl vs. 1.66±0.04 g/dl) and globulins (3.08±0.05 g/dl vs. 2.79±0.09 g/dl) were observed in the control group vs. the infertile group; and, in the infertile group, women with endometriosis and ovarian failure showed lower PT and albumin concentrations than women with other infertility diagnoses. On the other hand, no difference was found in the concentrations of 3-NT between the control group vs infertile women (28.40±1.79 ng/ml vs. 26.83±2.20 ng/ml), nor were differences observed within the group of infertile women based on their diagnoses.

In chapter III, polymorphisms in the TNP1, TNP2, PRM1 and PRM2 genes were studied in fertile and infertile Ecuadorian mestizo men. For this, 144 men were included (43 control and 101 infertile group) who underwent a spermiogram and peripheral blood sampling. Peripheral blood DNA extraction, polymerase chain reaction (PCR) and sequencing of these genes were performed. Nine polymorphisms were identified, none of which were related to fertility and would not be a risk factor for male infertility. The identified polymorphisms were rs62180545 in TNP1, rs11640138 and rs56069754 in TNP2, rs201923496 and rs737008 in PRM1, rs749752404, rs1646022, rs2070923 and rs18211 4260 in PRM2. The only polymorphisms not previously described in other populations were rs749752404 and rs182114260 of PRM2.

In chapter IV, the levels of protamination/packaging of chromatin and expression of PRM1 and PRM2 (RNA) in spermatozoa from fertile and infertile men were studied. For this, 131 individuals were included (35 control group and 96 infertile patients), who underwent a semen analysis, and seminal sample was subjected to swim up sperm selection technique and divided into aliquots in cryopreservation tubes and stored at -196°C until further processing. The indirect evaluation of chromatin packaging in spermatozoa was performed using the chromomycin A3 (CMA3) assay, while for the evaluation of PRM1 and PRM2 genes expression, RNA extraction, cDNA, and real-time PCR were performed with Power SYBR® Green PCR Master Mix reagent. The BETA-ACTIN (BA) gene was considered as the reference gene. Results showed a higher percentage of CMA3 spermatozoa in the infertile group vs. the control group (15.37 ± 1.00 vs. 12.10 ± 1.01, P = 0.01). Within the control group, CMA3 levels were increased in individuals with type I overweight and obesity compared to normal weight, being these levels as high as those

found in the infertile group. Also, within the control group, individuals with varicocele who underwent surgery had lower CMA3 levels compared to individuals who did not undergo surgery. On the other hand, when evaluating the mean expression levels (ΔCT) of PRM1 and PRM2, as well as the PRM1/PRM2 ratio, no differences were found between both experimental groups. When evaluating the influence of body mass index on the results, only differences were found in the PRM1/PRM2 ratio of infertile patients between individuals with normal weight vs. overweight (P=0.001).

The results of this work suggest that the concentration of total proteins in the FFH might be considered as a marker within the assisted reproduction treatment; and the analysis of the state of protamination (CMA3) would allow an identification of a possible cause of infertility in men cataloged with idiopathic infertility.