Estudio de las implicaciones funcionales de la proteína oviductina en la fertilidad y el desarrollo embrionario en hámster dorado y conejo utilizando la tecnología CRISPR-Cas9

Abstract

La infertilidad es un problema clínico muy extendido que afecta al 8 12% de las parejas en todo el mundo. De ellas, alrededor del 30% son diagnosticadas de infertilidad idiopática. La infertilidad relacionada con el factor femenino representa alrededor del 40-50% de los casos totales de infertilidad. Dentro de los posibles motivos de infertilidad idiopática, cabe destacar las probables alteraciones presentes en genes implicados en la fecundación y el desarrollo embrionario temprano. Así, las causas genéticas constituyen el 5-10% de todas las mujeres infértiles. El oviducto, denominado trompa de Falopio en la especie humana, y en particular el fluido oviductal (FO) crea un microambiente que interviene en procesos claves para la fecundación y la correcta fisiología del gameto y del embrión. La oviductina o glicoproteína oviductal 1 codificada por el gen OVGP1, es la proteína no sérica mayoritaria en el FO, habiendo sido identificada en diferentes especies de mamíferos, incluido el conejo, el hámster y el ser humano. En base a estas premisas el objetivo principal de la presente Tesis Doctoral ha sido comprobar el papel desempeñado por la proteína oviductina en la fecundación y en el desarrollo embrionario temprano, usando como modelos animales KO (del inglés, knock out) las especies hámster dorado (Mesocricetus auratus) y conejo común (Oryctolagus cuniculus). Este estudio ha permitido valorar si la presencia de oviductina es imprescindible para una correcta función reproductiva en estas especies. El segundo objetivo, también relacionado con el gen OVGP1, fue su análisis filogenético en la subfamilia Murinae. Dentro de esta subfamilia encontramos al ratón, que posee una proteína oviductina funcional, y a la rata, donde OVGP1 es un pseudogen. Este análisis ha permitido datar en qué fecha se produjo dicha pseudogenización, así como determinar qué otras especies se ven también afectadas por este proceso dentro de esta subfamilia. El tercer y último objetivo de esta Tesis está relacionado con el bloqueo de la polispermia. La poliploidía es una condición indeseable que provoca el fracaso del desarrollo embrionario. Para evitarla, el bloqueo de la polispermia impide la fecundación del óvulo por más de un espermatozoide. Dependiendo de la especie de mamífero, el bloqueo de la polispermia se produce a diferentes niveles: el oolema, la zona pelúcida (ZP) o ambos. En el bloqueo de la polispermia a nivel de la ZP, la proteasa ovastacina y la proteína ZP2 desempeñan un papel crucial. En el caso del conejo, el bloqueo de la polispermia se produce a nivel del oolema. Por tanto, el propósito científico ha sido determinar el mecanismo responsable de este proceso, para ello mediante análisis genómico se estudió la existencia de una pseudogenización del gen ASTL, gen codificante de la proteína ovastacina, en lagomorfos. Para el primer objetivo, se comenzó con la caracterizaron de ambos modelos animales KO para OVGP1 mediante experimentos de biología molecular y proteómica. A continuación, se analizó la fertilidad in vivo determinando si la ausencia de la proteína oviductina desencadena alteraciones de la fertilidad en estas especies. Para valorar los motivos causales de dichas alteraciones se realizó un estudio histológico de oviducto, un análisis del desarrollo embrionario preimplantacional, así como un análisis transcriptómico comparado de oviducto y embriones. Para el segundo objetivo se analizó mediante PCR la secuencia genómica del gen Ovgp1 en 22 especies de la subfamilia Murinae, obteniendo el árbol filogenético que nos permite datar la pseudogenización de Ovgp1 en esta subfamilia. Para el tercer objetivo se analizó mediante PCR la secuencia genómica de ASTL en 9 especies de lagomorfos determinando la pseudogenización de ASTL. En conclusión, los modelos animales KO para OVGP1 presentados en esta Tesis han demostrado que la proteína oviductina es esencial para un correcto desarrollo embrionario en hámster, pero no en conejo. El análisis filogenético del gen Ovgp1 en la subfamilia Murinae ha permitido datar su pseudogenización hace aproximadamente 12,5 millones de años, viéndose afectadas, a parte de la rata, otras especies pertenecientes a la tribu Rattini. Finalmente, el análisis genómico de ASTL en lagomorfos ha confirmado su pseudogenización en estas especies, pudiendo ser el motivo por el cual el bloqueo de la polispermia no se produce a nivel de la ZP en estas especies.

Infertility is a widespread clinical problem affecting 8-12% of couples worldwide. Of these, about 30% are diagnosed as idiopathic infertility, as no causal factor is found. Female factor-related infertility accounts for about 40-50% of all infertility cases. Among the possible reasons for idiopathic infertility, probable alterations in genes involved in fertilisation and early embryonic development are worth mentioning. Genetic causes account for 5-10% in all infertile women. The oviduct, known as the fallopian tube in humans, and in particular the oviductal fluid (OF) creates a microenvironment that is involved in key processes for fertilisation and the correct physiology of the gamete and embryo. Oviductin or oviductal glycoprotein 1, encoded by the OVGP1 gene, is the major non-serum protein in the OF, having been identified in different mammalian species, including rabbits, hamsters and humans. Based on these premises, the main objective of this Thesis has been to test the role played by the oviductin protein in the modulation of fertilisation and early embryonic development, using the golden hamster (Mesocricetus auratus) and common rabbit (Oryctolagus cuniculus) species as KO animal models. In addition, this study has allowed us to assess whether the presence of oviductin is essential for correct reproductive function in these species. The second objective, also related to the OVGP1 gene, was its phylogenetic analysis in the Murinae subfamily. Within this subfamily we find the mouse, which has a functional oviductin protein, and the rat, where OVGP1 is a pseudogene. This analysis has made it possible to date the pseudogenisation of OVGP1, as well as determine which other species within this subfamily are also affected by this process. The third and last objective of this thesis is related to the block to polyspermy. Polyploidy is an undesirable condition that results in the failure of embryonic development. To prevent it, blocking polyspermy prevents fertilisation of the egg by more than one spermatozoa. Depending on the mammalian species, block to polyspermy can occurs at different levels: the oolemma, the zona pellucida (ZP) or both. By block to polyspermy at the level of the ZP, the proteins ovastacin and ZP2 play a crucial role. In the rabbit, block to polyspermy occurs at the level of the oolemma. Therefore, the scientific aim was to determine by genomic analysis whether there is pseudogenisation of the ASTL gene, the gene coding for the ovastacin protein, in lagomorphs. For the first objective, we began by characterising both KO OVGP1 animal models by molecular biology and proteomics experiments. Next, in vivo fertility was analysed by determining whether the absence of the oviductin protein triggers fertility alterations in these species. To assess the causal reasons for these alterations, a histological study of the oviduct, an analysis of pre implantation embryo development, as well as a comparative transcriptomic analysis of the oviduct and embryos were carried out. For the second objective, the genomic sequence of the Ovgp1 gene in 22 species of the Murinae subfamily was analysed by PCR, obtaining the phylogenetic tree that allows us to date the pseudogenisation of Ovgp1 in this subfamily. For the third objective, the genomic sequence of ASTL in 9 species of lagomorphs was analysed by PCR to determine the pseudogenisation of ASTL. In conclusion, the OVGP1 KO animal models presented in this Thesis have shown that the oviductin protein is essential for correct embryonic development in hamsters, but not in rabbits. The phylogenetic analysis of the Ovgp1 gene in the Murinae subfamily has allowed us to date its pseudogenisation to approximately 12.5 million years ago, affecting, apart from the rat, other species belonging to the Rattini tribe. Finally, genomic analysis of ASTL in lagomorphs has confirmed its pseudogenisation in these species, which may be the reason why the block to polyspermy does not occur at the level of the ZP in lagomorphs.