Papel de los genes "Calcineurin b-like protein 10 (SLCBL10)" y "Respiratory burst oxidase g (SlRBOHG)" en la respuesta de tomate a estreses abióticos

Abstract

El cambio climático está teniendo dramáticas consecuencias en la agricultura a nivel mundial debido a los múltiples estreses abióticos. En Europa, el área Mediterránea es la más afectada por el cambio climático, donde se han intensifico los diferentes estreses abióticos como salinidad debido a la escasez de aguas de buena calidad, sequía y la frecuencia e intensidad de altas temperaturas. Ante los efectos negativos del cambio climático sobre la productividad de los cultivos de interés agronómico como tomate (Solanum lycopersicum) y las predicciones del aumento de la población a nivel mundial con el consiguiente incremento de la demanda de alimentos, un objetivo prioritario en la actualidad es avanzar en el conocimiento de los mecanismos y genes implicados en la tolerancia a estreses abióticos. Los objetivos propuestos en este trabajo son avanzar en el conocimiento sobre el papel de dos genes claves de tomate involucrados en la tolerancia a estreses abióticos a lo largo del ciclo de desarrollo de las plantas: CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN CBL10 (SlCBL10) y RESPIRATORY BURST OXIDASE G (SLRBOHG). Para el logro de estos objetivos, se han combinado análisis fenotípicos y agronómicos de plantas cultivadas en diferentes condiciones experimentales, incluyendo condiciones controladas, semi-controladas y no controladas, así como análisis a niveles anatómicos, fisiológicos y moleculares. El gen SlCBL10 tiene un papel importante en el desarrollo reproductivo de tomate, ya que la anulación del gen reducía significativamente el rendimiento en fruto cuando el cultivo se realizaba en condiciones óptimas. Además, también está involucrado en la incidencia de Blossom End Rot (BER); los efectos del silenciamiento del gen SlCBL10 sobre esta fisiopatia están relacionados con las alteraciones en la homeostasis del Ca2+ ya que se observa una reducción en el transporte de Ca2+ hacía los órganos sumidero que necesitan este nutriente para su desarrollo. Una característica muy interesante del gen SlCBL10 es el papel opuesto en parte aérea y raíz cuando el cultivo se realiza en condiciones salinas. El silenciamiento de SlCBL10 induce hipersensibilidad a la sal en parte aérea, y por tanto es un regulador positivo de la tolerancia en esta parte de la planta, mientras que es un regulador negativo de la tolerancia a salinidad en raíz puesto que la pérdida de función del gen confiere tolerancia a la sal cuando se utiliza como portainjerto. Interesantemente, los portainjertos que tienen silenciado el gen SlCBL10 son capaces de aumentar el rendimiento en fruto de las plantas sin transformar (WT) utilizadas como genotipo parte aérea, y la tolerancia a la salinidad de las plantas injertadas está relacionada con cambios en la homeostasis de Na+ y K+ y en la expresión de los principales genes implicados en el transporte de ambos iones claves en la tolerancia. Además, los primeros resultados sobre et papel de SlCBL10 en la tolerancia del tomate a otros estreses abióticos, como sequía y estrés por altas temperaturas, muestran que la sobreexpresión del gen induce sensibilidad al estrés térmico, contrariamente a la respuesta observada para estrés salino. Estos resultados son de gran interés para avanzar en el conocimiento sobre los mecanismos predominantes en una combinación de estreses abióticos, lo que es clave dados los multiples estreses abióticos que afectan al desarrollo de la plantas en condiciones mediterraneas. Los avances en el conocimiento sobre el papel del gen SlRBOHG involucrado en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) se han llevado a cabo mediante la caracterización de dos mutantes que tienen anulada la expresión del gen, denominados sodgat1-2 (del inglés sodium gatherer) por el transporte masivo de Na+ desde la raíz hasta la parte aérea. La anulación del gen SlRBOHG provoca una alta sensibilidad a la salinidad asociada con un alto transporte de agua y Na+ desde la raíz a la parte aérea, respuesta observada tanto en condiciones no transpirantes (in vitro) como transpirantes (in vivo). Estas alteraciones fisiológicas están principalmente asociadas a los cambios de expresión de los transportadores iónicos en las raíces de los mutantes y, especialmente, a la reducción de la expresión de SlHKT1;2, el más importante gen implicado en 24

el control de la homeostasis de Na+ en tomate. Esta respuesta es dependiente de la producción de H2O2 en condiciones salinas, como los mutantes no acumulan H2O2 con la salinidad, contrariamente a la mayor producción de H2O2 en plantas WT. Interesantemente, la alta sensibilidad a la salinidad provocada por la disrupción del gen SlRBOHG se mantiene a lo largo del ciclo de cultivo y en diferentes condiciones ambientales, lo que demuestra que SlRBOHG es un gen clave en el desarrollo vegetativo y, especialmente, reproductivo donde la pérdida de función provoca importantes pérdidas de producción. Además, por primea vez se demuestra que el principal efecto provocado por la disrupción del gen SlRBOHG a nivel reproductivo es el alto porcentaje de abscisión de flores inducido por la salinidad, donde se producen importantes cambios en la zona de abscisión (ZA) del pedicelo de la flor. Entre los procesos afectados en la abscisión, se observan alteraciones hormonales inducidas por la disrupción del gen SlRBOHG, como los niveles reducidos de auxina y ABA en hoja y flor del mutante, y alteraciones en los metabolitos primarios, especialmente los azúcares que reducen su transporte desde la hoja fuente hacia la flor y fruto bajo salinidad. Pero la abscisión parece estar principalmente relacionada con el alto transporte de Na+ a la ZA del mutante, puesto que la acumulación de Na+ en la ZA es incluso mayor que los valores encontrados en las flores. Estos resultados servirán como base para avanzar en la identificación de los procesos implicados en la abscisión prematura de órganos reproductivos, ya que la abscisión es un carácter agronómico de gran importancia para mantener la producción frente a las condiciones de cambio climático. Finalmente, ensayos de coexpresión simultánea de los genes SlCBL10 y SlRBOHG con diferentes CIPKs en cultivos celulares HEK, mostraron que el módulo SlCBL10-SlCIPK23 es capaz de activar a SlRBOHG, dando un lugar a un aumento significativo de ROS en presencia de Ca2+, lo que pone de manifiesto, que los dos genes de estudio de esta tesis doctoral, SlCBL10 y SlRBOHG, pueden tener una función conjunta clave en el diálogo cruzado entre Ca2+ y ROS para la señalización del estrés en tomate. 25

Climate change has dramatic consequences on agriculture worldwide because of the intensified impact of multiple abiotic stresses on crops. In Europe, the Mediterranean area is the most affected by climate change, where frequency, intensity and duration of stresses such as drought, high temperatures and salinity have been increasing, and in the particular case of the last one because of use by farmers of water with high levels of salts due to scarcity of good quality water sources. Given the negative effects of these stresses on the productivity of crops of such agro-economic importance as tomato (Solanum lycopersicum), which is the horticultural species supplying most of the functional compounds to the human diet due to its so high per capita consumption, and considering the predictions of a rising world population driving an increase in food demand, a priority research objective in agrarian science is to advance in the knowledge of the mechanisms and genes involved in tolerance to abiotic stresses, particularly in crops of such agronomic interest as it is tomato. The objective of this thesis is to advance in the knowledge of the role of two key tomato genes involved in tolerance to abiotic stresses throughout the plant development cycle: CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN CBL10 (SlCBL10) and RESPIRATORY BURST OXIDASE G (SIRBOHG). To achieve these objectives, phenotypic and agronomic analyses of plants grown under different experimental conditions have been combined, including controlled, semi-controlled and uncontrolled growth conditions, as well as analyses fulfilled at anatomical, physiological and molecular levels. Regarding the study on SlCBL10 gene, it has been verified that it plays a very important role in reproductive development of tomato, since the knockout mutation of this gene significantly reduces fruit yield when plants are grown under optimal conditions. In addition, it is also involved in the incidence of Blossom End Rot (BER). Effects of knockout mutation or silencing of the gene are very much related to alterations in Ca2+ homeostasis, since it is observed a reduction in Ca2+ transport to sink organs that required this nutrient for their development. A very interesting characteristic of SlCBL10 is its opposite role in shoot and root when the plant is grown in saline conditions. Thus, disruption or silencing of the gene induces hypersensitivity to salt stress in the shoot and therefore it is a positive regulator of tolerance in this part of the plant, while it is a negative regulator of such tolerance in the root since plant material with loss-of-function of the gene confers salt tolerance when used as a rootstock. Interestingly, the rootstock carrying the silencing SlCBL10 gene are capable of increasing fruit yield of untransformed plant (WT) used as scion, and salinity tolerance of grafted plants is related to changes in Na+ and K+ plant homeostasis, and of expression of the main genes encoding transporters of both cations. Furthermore, the first results on the role of SlCBL10 in tomato tolerance to other abiotic stresses are presented, such as drought and high temperatures, and they hint at the fact that show that SlCBL10 overexpression induces sensitivity to heat stress, contrary to the response observed for salt stress. These results have a great interest to advance in the knowledge about the predominant mechanisms triggered in the plant response to a combination of abiotic stresses, which has a key importance given the 26

multiple abiotic stresses that affect crop growth and production in Mediterranean environmental conditions. Advances in the knowledge about the role of the SlRBOHG tomato gene, involved in the production of reactive oxygen species (ROS), have been carried out via the characterization of two mutants showing inhibition of the gene expression, called sodgat1-2 (sodium gatherer 1-2). These two mutants are characterized by the massive transport of Na+ from the roots to the shoot when grown in saline conditions. The knockout mutation of SlRBOHG causes a high sensitivity to salinity associated with a high transport of water and Na+ from root to shoot, a response observed both in non-transpiration (in vitro) and transpiration (in vivo) conditions. This physiological alteration is mainly associated with changes in the expression of ion transporters in mutant roots, in particular with the reduction of the expression of SlHKT1;2, one of the most important genes involved in regulation of Na+ homeostasis in tomato. This response depends on the production of H2O2 under saline conditions, since the sodgat1-2 mutants do not accumulate it with salinity, contrary to WT plants. Interestingly, the high sensitivity to salinity caused by disruption of the SlRBOHG is maintained throughout the plant cycle and in different environmental conditions, which hints at SlRBOHG as a key gene in vegetative development and, especially, in reproductive development, where loss-of-function causes major production losses. In addition, for the first time it is shown that the main effect caused by disruption of SlRBOHG at the reproductive level is a high degree of flower abscission induced by salinity, where important changes occur in the abscission zone (AZ) of the flower pedicel. Among the processes affected in the induced abscission under salinity, we have observed hormonal alterations such as reduced levels of auxin and ABA in leaves and flowers of the mutants and alterations in the levels of primary metabolites, especially sugars that experience a reduction of their transport from the source leaf towards sink flower and fruit. But abscission seems to be mainly linked to high transport of Na+ to the AZ in the mutants, since the accumulation of this cation in the AZ is even higher than the values detected in the flowers. These results will serve as a basis to advance in the identification of the key processes involved in premature abscission of reproductive organs, since flower abscission is an agronomic trait of critical importance to maintain production in climate change conditions. Finally, simultaneous co-expression tests of SlCBL10 and SlRBOHG genes with different CIPKs in HEK cells cultures showed that the SlCBL10-SlCIPK23 module is capable of activating SlRBOHG, leading to a significant increase in ROS in the presence of Ca2+. This last result evidence that these two genes, objectives of study in this PhD thesis, SlCBL10 and SlRBOHG, may have a key joint function in the crossover dialogue between Ca2+ and ROS for stress signalling in tomato