Tiorredoxina o1 mitocondrial y nuclear : implicación en autofagia, señalización hormonal y en persulfuración bajo estrés salino

Abstract

Las tiorredoxinas, proteínas de bajo peso molecular, tienen un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis redox celular. Estas enzimas se caracterizan por presentar un sitio activo conservado (WCGCP) compuesto por dos residuos de cisteína a través del cual regulan la estructura y función de sus proteínas diana específicas mediante reducción de residuos de Cys oxidados en puentes disulfuro. Las diferentes isoformas de las TRXs pueden encontrase en distintos compartimentos celulares. Concretamente, la TRXo1, objeto de estudio de esta Tesis Doctoral, presenta una localización dual, hallándose tanto en mitocondrias como en núcleo, analizándose su implicación en procesos como la autofagia celular y en procesos dependientes de la fitohormona ABA a través de la regulación de nuevas dianas proteicas. Dentro del primer Objetivo propuesto, utilizando como modelos de estudio suspensiones de células de tabaco BY-2 control y sobreexpresantes (OEX) Pstrxo1, se ha estudiado la posible implicación de TRXo1 en la viabilidad celular tras un tratamiento oxidativo con H2O2, a través de la regulación de la proteína ATG4 (Autophagy related protein 4), clave en el proceso de autofagia celular. Como resultado, se observó una elevada actividad de ATG4 en las células OEX sometidas al tratamiento oxidativo, junto con la demostrada interacción in vitro entre las proteínas ATG4 y TRXo1, sugiriendo un papel para esta tiorredoxina en el control redox de la proteína ATG4 in vivo. En este sentido, la TRXo1 se postula como un componente clave en el proceso de autofagia que tiene lugar en la respuesta de las células TBY-2 a la situación oxidativa, colaborando en el aumento de la tasa de supervivencia celular que presentan las células sobreexpresantes. Además, dentro del segundo Objetivo parcial propuesto, se analizó la regulación redox de PYR1 (Pyrabactin Resistance 1), receptor de ABA, mediada por TRXo1 y su implicación en procesos dependientes de esta fitohormona como son el crecimiento de la raíz y el cierre estomático, analizados en mutantes KO y sobreexpresantes (OEX) Attrxo1 de plantas de Arabidopsis thaliana L. ecotipo Columbia, así como en estudios in vitro con proteínas recombinantes de PYR1 wild type y mutadas en sus cisteínas, sometidas a ensayos de óxido-reducción. Se ha demostrado una regulación redox de este receptor que provoca cambios en su estado oligomérico, estando dos de sus tres cisteínas, concretamente Cys30 y Cys65, implicadas en el mismo. A su vez, el sistema tiorredoxina reductasa/ TRXo1 era capaz de rescatar la pérdida de la actividad de PYR1 por oxidación, y de esta forma su capacidad para inhibir a fosfatasas implicadas en la señalización por ABA, como es la proteína HAB1. Los estudios in vivo han corroborado que la oligomerización de PYR1 es dependiente del estado redox, encontrándose además un patrón diferencial en la oligomerización del receptor en plantas KO y sobreexpresantes Attrxo1 crecidas en presencia de ABA, comparadas con el patrón presentado por el genotipo silvestre. Todo ello permite describir por vez primera, la implicación del proceso de regulación redox por TRXo1 sobre el receptor PYR1, que puede ser un evento clave para favorecer la señalización por ABA, siendo esta tiorredoxina una buena candidata como reductor fisiológico in vivo de estos receptores en el núcleo. También, se estudia la participación de AtTRXo1 en procesos de persulfuración proteica (Objetivo 3), modificación postraduccional sobre residuos de Cys, en plantas mutantes knock out (KO) y sobreexpresantes (OEX) Attrxo1 crecidas bajo condiciones de estrés salino, presentándose por primera vez un estudio sobre patrones de persulfuración proteica producida por sulfuro de hidrógeno (H2S) en condiciones de salinidad, en el que algunas dianas de TRXo1 en mitocondrias y núcleo, así como proteínas del sistema antioxidante y del metabolismo del H2S entre otras, se encuentran diferencialmente persulfuradas en mutantes KO Attrxo1. Este patrón sugiere que TRXo1 puede ejercer un papel como posible moduladora del proceso de persulfuración en estas condiciones de estrés abiótico, aspecto interesante en el que se ahondará próximamente. Por otro lado, se han obtenido dobles mutantes de Tiorredoxina Reductasa B (NTRB) y de TRXo1 (Psntrb/trxo1) de Pisum sativum L. cv. Bonneville, por la técnica de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) y de A. thaliana (Attrxo1/ntrb) por cruzamiento de mutantes simples KO en cada uno de los genes (Objetivo 4). Se ha iniciado la caracterización de los mismos como paso previo a su empleo en los estudios dirigidos a profundizar en la participación de la regulación redox ejercida por este sistema, en la respuesta de plantas a situaciones de estrés abiótico, donde la TRXo1 tiene un papel que se evidencia cada vez más, como relevante.

Thioredoxins, low molecular weight proteins, play a fundamental role in the maintenance of cellular redox homeostasis. These enzymes are characterized by a conserved active site (WCGCP) composed of two cysteine residues through which they regulate the structure and function of their specific target proteins by reducing oxidized Cys residues in disulfide bridges. The different isoforms of TRXs can be found in different cellular compartments. Specifically, TRXo1, the object of study of this Doctoral Thesis, presents a dual localization, being found both in mitochondria and in the nucleus, and its involvement in processes such as cell autophagy and in processes dependent on the phytohormone ABA through the regulation of new protein targets is being analyzed. Within the first proposed Objective, using as study models suspensions of BY-2 control and overexpressing (OEX) Pstrxo1 tobacco cells, we have studied the possible involvement of TRXo1 in cell viability after oxidative treatment with H2O2, through the regulation of the ATG4 protein (Autophagy related protein 4), key in the process of cellular autophagy. As a result, elevated ATG4 activity was observed in OEX cells subjected to oxidative treatment, together with the demonstrated in vitro interaction between ATG4 and TRXo1 proteins, suggesting a role for this thioredoxin in the redox control of ATG4 protein in vivo. In this sense, TRXo1 is postulated as a key component in the autophagy process that takes place in the response of TBY-2 cells to the oxidative situation, collaborating in the increase of the cell survival rate presented by overexpressing cells. In addition, within the second proposed partial Objective, the redox regulation of PYR1 (Pyrabactin Resistance 1), ABA receptor, mediated by TRXo1 and its implication in processes dependent on this phytohormone such as root growth and stomatal closure, were analyzed in KO mutants and Attrxo1 overexpressing (OEX) of Arabidopsis thaliana L. ecotype Columbia, as well as in vitro studies with wild-type and cysteine-mutated PYR1 recombinant proteins subjected to oxidation-reduction assays. A redox regulation of this receptor that causes changes in its oligomeric state has been demonstrated, with two of its three cysteines, specifically Cys30 and Cys65, being involved in it. In turn, the thioredoxin reductase/ TRXo1 system was capable of rescuing the loss of PYR1 activity by oxidation, and thus its capacity to inhibit phosphatases involved in ABA signaling, such as the HAB1 protein. In vivo studies have corroborated that PYR1 oligomerization is redox state-dependent, and a differential pattern of receptor oligomerization was found in KO and Attrxo1 overexpressing plants grown in the presence of ABA, compared with the pattern presented by the wild-type genotype. All this allows us to describe for the first time, the involvement of the redox regulation process by TRXo1 on the PYR1 receptor, which may be a key event to favor ABA signaling, being this thioredoxin a good candidate as a physiological reductant in vivo of these receptors in the nucleus. Also, the participation of AtTRXo1 in protein persulfuration processes (Objective 3), posttranslational modification on Cys residues, is studied in Attrxo1 knock-out (KO) and overexpressing (OEX) mutant plants grown under salt stress conditions, presenting for the first time a study on patterns of protein persulfuration produced by hydrogen sulfide (H2S) under salinity conditions, in which some TRXo1 targets in mitochondria and nucleus, as well as proteins of the antioxidant system and H2S metabolism, among others, are differentially persulfurated in KO Attrxo1 mutants. This pattern suggests that TRXo1 may play a role as a possible modulator of the persulfuration process under these abiotic stress conditions, an interesting aspect that will be further explored in the near future. On the other hand, double mutants of Thioredoxin Reductase B (NTRB) and TRXo1 (Psntrb/trxo1) have been obtained from Pisum sativum L. cv. Bonneville, by virus-induced gene silencing technique (VIGS) and of A. thaliana (Attrxo1/ntrb) by crossing KO single mutants in each of the genes (Objective 4). The characterization of these genes has been initiated as a previous step to their use in studies aimed at deepening the participation of the redox regulation exerted by this system in the response of plants to abiotic stress situations, where TRXo1 has a role that is increasingly evidenced as relevant