Determinación del tiempo de isquemia caliente óptimo en el trasplante cardíaco en donación en asistolia a través del análisis del proceso de lesión del cardiomiocito durante la parada cardiaca en donantes tipo III de Maastricht

Abstract

Introducción: El trasplante de corazón es el tratamiento de elección para pacientes candidatos con insuficiencia cardíaca avanzada. Nuestro país ha desarrollado en los últimos años una actividad récord de donación y trasplante, basada fundamentalmente hasta hace relativamente poco tiempo en la donación de pacientes fallecidos en situación de muerte encefálica (ME). No obstante, pese a una actividad de trasplante en 2022 que registra 46,3 donantes y 113,4 procedimientos por millón de población (pmp), dicha actividad resulta insuficiente para cubrir las necesidades de trasplante de nuestra población. En este escenario, la donación en asistolia (DA) surge como una prometedora alternativa y, tal como ha demostrado en los últimos años, una fuente efectiva para la donación de órganos. En 2022 la DA creció un 38% y ya representa el 42% del total de donantes, siendo España el único país del mundo que trasplanta todo tipo de órganos de donantes en asistolia. La inclusión de los donantes en asistolia dentro del pool de posibles donantes se estima que podría incrementar el número de trasplantes cardíacos entre un 15-30%. Sin embargo, al contrario que en el proceso de donación tras ME, en la DA los órganos sufren un período de isquemia caliente entre la retirada del tratamiento de soporte vital (RTSV) y la fase de asistolia o cese circulatorio, y la obtención del injerto cardíaco. En este contexto, emana la preocupación sobre la funcionalidad y calidad de ese injerto. Objetivos: El objetivo principal del estudio fue analizar el proceso de degradación y muerte celular en la parada cardiocirculatoria (PCR) desde el punto de vista bioquímico y relacionarlo temporalmente para identificar el momento en el que se produce la lesión irreversible del cardiomiocito. El objetivo secundario era determinar el tiempo crítico de isquemia caliente en el trasplante cardíaco basándonos en una monitorización estrecha in vivo de los cambios bioquímicos que experimentan los cardiomiocitos durante el proceso de DA de órganos abdominales y pulmones. Metodología: Se llevó a cabo un estudio unicéntrico y prospectivo realizado en el Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca. Se sometió a donantes en asistolia tipo III de Maastricht no cardíacos a biopsias endomiocárdicas seriadas inmediatamente antes de la RTSV, en situación de PCR y cada 2 min a partir de entonces. Las muestras se procesaron en grupos representativos para evaluar la homeostasis del calcio, la función mitocondrial y la viabilidad celular. Los potenciales donantes consecutivos ingresados entre junio de 2017 y junio de 2019 que cumplieron con los criterios de inclusión fueron aceptados en el estudio: edad de 18 a 75 años, sin cardiopatía estructural y con consentimiento informado firmado por sus representantes legales. Se determinó la capacidad contráctil celular a través del estudio de la homeostasis del Ca2+ analizando por una parte el estado de fosforilación de la enzima proteína quinasa A (PKA) y por otro el estado de activación/fosforilación de la enzima fosfolambano (PLN), reguladora de la Ca2+-ATPasa de retículo sarcoplasmático (SERCA2a). Se cuantificó las células miocárdicas en los inicios de activación de apoptosis a través de la determinación de los niveles de activación de las caspasas 3 y 7, usando la técnica de espectrofluorimetría y Western blot. La función mitocondrial, como medida de la capacidad de generación de energía del miocardio aislado, se valoró mediante la medida de las actividades enzimáticas de los complejos I y IV de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Resultados: La población final de nuestro estudio estuvo compuesta por 16 donantes en asistolia controlada tipo III de Maastricht (de un total de 56 donantes en asistolia controlada tipo III de Maastricht que fueron atendidos durante el período de reclutamiento del estudio: 26 sujetos no cumplieron con los criterios de inclusión y de los 30 donantes que sí cumplieron los criterios, 14 fueron excluidos por razones logísticas o sociales). Para la mayoría de los donantes, la causa de adecuación de la terapia de soporte vital fue la hemorragia intracraneal. La mediana de tiempo desde la RTSV hasta la PCR fue de 9 min (percentil 25-75: 7–13 min; rango: 4–19 min). Se produjo hipoperfusión (caída de la presión arterial sistólica <60 mmHg) en una mediana de 5,5 min antes de la PCR. Se observó que los niveles de la forma fosforilada de la enzima PKA sobre su residuo activo Thr197 disminuyeron de forma significativa a partir de los 10 min de la PCR (p < 0,001). Del mismo modo, el estado de fosforilación de PLN sobre el residuo de Ser16, disminuyó de forma significativa tras 10 min de la PCR en comparación con el estado de fosforilación evaluado a nivel basal. Cuando evaluamos el estado de PLN en su forma monomérica (forma no fosforilada total) el nivel de acumulación fue incrementando de forma significativa a partir de los 10 min de la PCR. Tanto las actividades conjuntas como aisladas de los complejos II y IV disminuyeron de forma tiempo-dependiente a partir de los 10 min de la PCR. La actividad caspasa 3/7 permaneció inalterada hasta los 10 min de la PCR, pero aumentó de forma significativa y dependiente del tiempo desde los 11 min tras la PCR. Se realizó también un análisis de sensibilidad analizando las muestras de donantes cuyos tiempos de RTSV hasta la PCR estaban por encima y por debajo del tiempo medio (9 min) por separado. En este análisis, no se encontraron diferencias entre los sujetos con tiempos menores (4–8 min) y más largos (9–19 min) en términos de contractilidad cardíaca, disfunción mitocondrial o muerte celular apoptótica Conclusiones: Los resultados de este estudio muestran que los parámetros bioquímicos de lesión celular del miocardio se ven significativamente comprometidos a partir de los 10 min de la PCR. El período comprendido entre la RTSV y la PCR no tuvo influencia sobre los parámetros bioquímicos de lesión celular analizados. Nuestros hallazgos indican que, en los cardiomiocitos humanos, el período comprendido entre la RTSV a la PCR, así como los primeros 10 min después de la PCR, no están asociados con un compromiso significativo e irreversible de la función contráctil o viabilidad celulares.

Introduction: Heart transplantation is the gold standard for treating end-stage heart failure. In recent years, our country has developed record donation and transplantation activity, based primarily on the donation of deceased patients in a situation of brain death (BD). However, despite a transplantation activity in 2022 of 46.3 donors and 113.4 procedures per million population (pmp), this activity is not enough to cover the transplantation requirements of our population. Donation after circulatory death (DCD) represents a promising opportunity to overcome the relative shortage of donors for heart transplantation. Nowadays Spain is the only country in the world that transplants all types of organs from DCD donors. In 2022, DCD grew by 38% and already represents 42% of the total number of donors in our country. Including DCD donors could increase the number of heart transplants by 15-30%. However, unlike conventional donation after BD, DCD organs undergo a period of warm ischemia during the withdrawal of life-sustaining therapy (WLST) and between circulatory arrest (CA) and heart procurement. In this context, there is concern about the functionality and quality of the graft. Objectives: The main objective of the study was to analyse the process of cell degradation and cell death in CA from a biochemical point of view and to relate it temporally in order to identify the moment at which irreversible cardiomyocyte injury occurs. The secondary objective was to determine the critical warm ischemia time based on in vivo biochemical changes during DCD procedure of abdominal organs and lungs. Methodology: This is a prospective single-center study conducted in Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca. All consecutive DCD Maastricht type III donors were screened from June 2017 to June 2019. Participants who met all the following inclusion criteria were included: age 18 to 75 years, no structural heart disease and signed informed consent provided by the legal representatives according to donor regulations. DCD non-cardiac donors underwent serial endomyocardial biopsies immediately before WLST, at CA and every 2 min thereafter. Samples were processed into representative pools to assess calcium homeostasis, mitochondrial function and cellular viability. SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and western blots were used to evaluate the phosphorylation of cAMP-dependent protein kinase A (PKA) and phospholamban (PLN), two proteins related to intracellular calcium transients. Myocardial cells at the onset of apoptosis activation were quantified by Caspase 3/7 activation levels, measured using luminescent assays. Mitochondrial function, as a measure of the energy-generating capacity of the isolated myocardium, was assessed by measuring the enzyme activities of complexes I and IV from the mitochondrial electron transport chain. Results: The final sample population of our study comprised 16 DCD Maastricht type III donors (from a total of 56 DCD donors who were handled during the study period: 26 subjects did not meet the inclusion criteria and of the 30 DCD donors who met the inclusion criteria, 14 subjects were excluded for social or logistical reasons). For most DCD donors, the cause of WLST was intracranial hemorrhage. The median time from WLST to CA was 9 min (25th-75th percentile: 7–13 min; range: 4–19 min). Hypoperfusion (systolic blood pressure <60 mmHg) occurred at a median of 5.5 min before CA. It was observed that the levels of the phosphorylated form of the enzyme PKA on its activating residue Thr197 significantly decreased 10 min after CA (p < 0.001). Similarly, the phosphorylation state of PLN on the Ser16 site decreased markedly 10 min after CA compared to the control assay (phosphorylation state assessed at baseline). When we evaluated the state of PLN in its monomeric form (total non-phosphorylated form) the level of accumulation was significantly increased 10 min after CA. Both the combined and isolated activities of complex II and complex IV in the mitochondrial electron transport chain decreased in a time-dependent way 10 min after CA. Caspase 3/7 activity remained unchanged until 10 min after CA, but increased significantly and time-dependently from 11 min after CA. We also performed a sensitivity analysis by analyzing the samples from donors whose times from WLST to CA were above and below the median time (9 min) separately. In this analysis, we found no differences between subjects with shorter (4–8 min) and longer (9–19 min) times in terms of cardiac contractility, mitochondrial dysfunction or apoptotic cell death. Conclusions: The results of this study suggest that myocardial contractility and cellular viability are significantly compromised 10 min after CA. The WLST period before CA did not affect the processes examined here. These findings suggest that, in human cardiomyocytes, the period from WLST to CA and the first 10 min after CA are not associated with a significant and irreversible compromise in cellular function or viability.