Estudio de la respuesta inflamatoria en el sistema nervioso central tras el aplastamiento completo del nervio óptico en ratón

Abstract

Objetivos El aplastamiento del nervio óptico (ApNO) produce una reacción inflamatoria que se extiende a la retina lesionada y la contralateral. Sin embargo, la propagación de la inflamación en la vía visual o fuera, en regiones remotas del SNC (RRSNC), ha sido menos caracterizada. Nuestro objetivo fue estudiar la respuesta glial y los cambios moleculares subyacentes en ambas retinas, colículos superiores (CS), principal área retino-recipiente en ratón, o en RRSNC. Material y métodos Los animales experimentales fueron ratones macho pigmentados (C57Bl/6) adultos. Se diferenciaron 3 grupos: ApNO a 0,5 mm del disco óptico; animales en los que se realizó toda la cirugía salvo el aplastamiento (Sham) e intactos. Se hicieron dos estudios: Estudio molecular: Se realizó la disección en fresco de ambas retinas, CS e hipocampos (H), bulbos olfatorio (BO), cerebelo (CE) y médula espinal (ME) como RRSNC a los días 1, 3, 9 ó 30 tras el ApNO o cirugía Sham. Se extrajo su ARN y, mediante qPCR, se determinaron los niveles de expresión de Tgf-β1, Il-1β, Tnf-α, Iba1, Gfap, Mhc II y Tspo en las retinas y el resto de regiones del SNC. En extractos de CS, H, BO, CE y ME, se determinó también Caspasa-3, Cxcr1, Lcn2, Il-6, Cd206, Il-4 y Aq4. Los genes se clasificaron como marcadores de apoptosis (Caspasa-3), pro-inflamatorios (Cxcr1, Il-1, Il-1β, Lcn2, Tnf-α, Il-6), antinflamatorios (Cd206, Il-4, Tgf-β1) y gliosis (Aq4, Gfap, Iba1, Mhc II, Tspo). Se usaron Hprt y Gapdh como genes housekeeping. Estudio anatomo-patológico: Se realizó en secciones sagitales de cerebro a los 3, 9 ó 30 días tras el ApNO o cirugía Sham. Se cuantificó el área ocupada por señal GFAP y la detección de MHC II (macroglía), así como la densidad de células Iba1+ y la expresión de CD68 (microglía), en CS y algunas RRSNC (H y BO). Se analizó la respuesta de animales ApNO vs. intactos o Sham, entre regiones ipsi- vs. contralaterales a la lesión y entre los diferentes tiempos de supervivencia. Resultados La cirugía Sham fue suficiente para modificar la expresión de los marcadores inflamatorios y gliales en las retinas y el resto de las regiones estudiadas del SNC. La retina cuyo nervio óptico fue expuesto pero no aplastado presentó una reacción pro-inflamatoria más precoz y mayor que la contralateral. En el resto del SNC, hubo un incremento generalizado de densidad de células Iba1+ o sobrexpresión de Iba1 pero sin cambios histológicos; sobrerregulación de Gfap junto con incremento del área ocupada por GFAP en ambos CS; y sobrexpresión de marcadores pro-inflamatorios y Caspasa-3. El ApNO no cambió de forma sustancial la reacción apoptótica, glial e inflamatoria ya obtenida por la cirugía Sham en RRSNC, es decir, fuera de la vía visual (retina y CS). La respuesta inflamatoria y glial fue evidente desde el primer día tras el ApNO en ambas retinas, aunque más larga y duradera en la lesionada. La reacción macroglial ocurrió solamente en la retina lesionada mientras que la respuesta microglial se encontró en ambas. El ApNO generó una respuesta mayor en el CS contralateral: se observó una intensa activación microglial junto con una respuesta pro-inflamatoria que condujo a la apoptosis. Conclusiones Tras el ApNO, la respuesta glial e inflamatoria en la vía visual ocurre en relación a la conexión entre las CGR axotomizadas y ambas retinas o CS. Fuera de la vía visual, la reacción es más global y podría seguir un gradiente según su disposición anatómica y la lesión. Para el análisis experimental de cualquier tejido del SNC donde sea de interés aislar la respuesta del ApNO del efecto de la cirugía en sí, se debería usar un animal Sham como control.

Objectives Unilateral Optic Nerve Crush (ONC) triggers a bilateral inflammatory reaction which extends to both injured and contralateral fellow retinas. However, few studies have investigated the spread of inflammation along visual pathway or in remote regions of Central Nervous System (RRCNS). Our aim was to study the glial response and the underlying molecular changes in retinas, superior colliculi (SCi), the main projection areas of retinal ganglion cells (RGC) in mice, or RRCNS at different distances from the lesion. Material and Methods The left optic nerves of adult pigmented C57Bl/6 male mice were crushed (ONC) at 0.5 mm from the optic disk or underwent surgery without crushing (Sham). Intact mice were used as controls. Two studies were carried out: Molecular study: At 1,3,9 or 30 days after ONC or Sham-surgery (dpl) both retinas and SCi or RRCNS (hippocampus -H-, olfactory bulb -OB-, cerebellum -CE- and spinal cord -SC-) were freshly dissected and their RNA extracted. Using qPCR we measured the expression levels of Tgf-β1, Il-1β, Tnf-α, Iba1, Gfap, Mhc II and Tspo in retinas and in the rest of CNS regions under study. In SCi, H, OB, CE and SC extracts we also analysed Caspase-3, Cxcr1, Lcn2, Il-6, Cd206, Il-4 and Aq4. We classified genes in apoptosis (Caspase-3), pro-inflammatory (Cxcr1, Il-1, Il-1β, Lcn2, Tnf-α, Il-6), anti-inflammatory (Cd206, Il-4, Tgf-β1) and gliosis markers (Aq4, Gfap, Iba1, Mhc II, Tspo). Hptr and Gapdh were used as housekeeping genes. Anatomopathological study: Immunodetection of microglia (CMi) and macroglial (CMa) cells was performed in sagittal brain sections at 3,9 or 30 dpl. The area occupied by GFAP and MHC II signals, as well as the density of Iba1+ and CD68+ cells were quantified in both SCi and selected RRCNS (H and OB). We analysed the response in animals with ONC compared with intact or Sham animal, ipsi- vs. contralateral regions to lesion and at different survival intervals. Results Sham surgery was sufficient to modify the expression of inflammatory and glial markers in retina and other regions of CNS that were studied. The retina of the exposed optic nerve without crushing showed an earlier and more pronounced pro-inflammatory reaction compared to the contralateral retina. In the rest of the CNS, there were a generalized increase of Iba1+ cell density or Iba1 upregulation, but no histological glial changes; Gfap overexpression with an increase of area occupied by GFAP in both SCi; and overexpression of pro-inflammatory markers and Caspase-3. Additionally, signs of glial reactivation (Tspo or Mhc II) were only present in the ipsilateral RRCNS, and the response in SC was delayed and less pronounced. ONC did not significantly modify the apoptosis, glial or inflammatory reaction that was already observed due to Sham surgery in RRCNS, which refers to areas outside the visual pathway (retina and SCi). The inflammatory and glial response was evident from the first day after ONC in both retinas, although it lasted longer in the injured retina. The macroglial reaction was exclusive to the injured retina, while the microglial response was found in both. ONC induced a stronger response in the contralateral SCi, including microglial reactivation and a pro-inflammatory response that led to apoptosis. Conclusions After ONC, glial and inflammatory response in visual pathway occurs in relation to the connection between axotomized RGC and both retinas or retino-recipient SCis. Outside the visual pathway, the reaction is more widespread and may follow a gradient depending on the anatomical distance to the lesion. In the experimental analysis of any CNS tissue, where isolating the response to ONC or any other lesion from the effect of the surgery itself is of interest, a Sham control should be used.