A novel role for the inflammasome in the regulation of hematopoiesis

Abstract

El inflamasoma es un complejo multiproteico que actúa como sensor del sistema inmunitario. Aunque este complejo ha sido ampliamente estudiado se desconoce el mecanismo por el que regula la hematopoyesis. Nuestro grupo ha demostrado previamente que el inflamasoma desempeña un papel importante en la eritropoyesis. La regulación de los niveles de GATA1 por el inflamasoma determina tanto la decisión eritroide-mieloide de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) como la diferenciación eritroide terminal. Este mecanismo está conservado en pez cebra, ratón y humano. En la presente tesis doctoral, utilizando las ventajas únicas del modelo de pez cebra para el cribado genético y farmacológico, en combinación con estudios bioquímicos y funcionales en células humanas K562, hemos demostrado que la inhibición farmacológica de caspase-1 rescata las alteraciones hematológicas en modelos de pez cebra de inflamación neutrofílica y de anemia de Diamond-Blackfan (DBA). Además, hemos identificado a NLRP1 como el inflamasoma responsable de la regulación de la decisión del linaje eritroide-mieloide de las HSPCs. Así, la inhibición genética de Nlrp1 provocó una reducción del número de neutrófilos y macrófagos, y un aumento del número de eritrocitos en larvas de pez cebra. Del mismo modo, la inhibición de este inflamasoma alivió la neutrofilia en un modelo de pez cebra de inflamación crónica. La regulación de la hematopoyesis por el inflamasoma tiene implicaciones clínicas, ya que las enfermedades inflamatorias crónicas suelen ir asociadas alteraciones hematopoyéticas. Por este motivo, hemos realizado un escrutinio de compuestos aprobados por la FDA/EMA para identificar inhibidores de NLRP1. Hemos identificado que la espironolactona inhibe específicamente la activación del inflamasoma NLRP1 en células HEK293T y, lo que es más importante, facilita la diferenciación eritroide de células K562 y HSPCs primarias humanas, y produce los mismos efectos de la inhibición genética de Caspa (caspasa a, la enzima análoga funcional de caspasa-1 humana) y Nlrp1 en el pez cebra. Además, es importante destacar que la espironolactona promovió la eritropoyesis en HSPCs de un paciente de DBA con la mutación común en RSP19 y, sorprendentemente, sin afectar a la mielopoyesis. Dado que la espironolactona es un fármaco aprobado por la FDA/EMA, resulta atractivo para su reposicionamiento en el tratamiento de la DBA. Otra cuestión importante que debe aclararse es el mecanismo de acción de la espironolactona, ya que su análogo eplerenona no consiguió inhibir el inflamasoma NLRP1 ni regular la hematopoyesis. Por consiguiente, es crucial conocer si las diferencias estructurales entre estos dos compuestos determinan su diferente actividad sobre el inflamasoma NLRP1. Finalmente, hemos observado un nivel adicional de regulación de la hematopoyesis por el inflamasoma que consiste en que GATA1 desplaza a GATA2 en el intrón 7 de CASP1 durante la diferenciación eritroide. Esta secuencia se encuentra conservada en primates indicando que podría ser importante para la regulación de la hematopoyesis en estos animales. Aunque la ausencia de este elemento en pez cebra y ratón ha dificultado en gran medida la caracterización de su relevancia y función, la deleción de los sitios de unión de GATA presentes en esta secuencia mediante la tecnología CRISPR-Cas9 en células humanas K562 ha revelado que regulaba negativamente la diferenciación eritroide terminal. Así, la línea mutante que carece de este elemento se diferenciaba más rápidamente, incluso en ausencia de hemina, y presenta unos niveles menores de la proteína GATA1. Además, ensayos de actividad luciferasa revelaron que esta secuencia tenía actividad promotora, que estaba regulada negativamente tanto por GATA1 como por GATA2, e impulsaba la transcripción de un fragmento corto tanto en las células K562 como en las HSPCs primarias. Sin embargo, deben realizarse experimentos adicionales para esclarecer el mecanismo de acción de este transcrito y si codifica una proteína o más bien actúa como un ARN no codificante.

The inflammasomes are molecular structures localized in the cytosol which activate the immune response. Although several key components of the inflammasome have already been characterized, the mechanism that establishes a relationship between inflammasome and hematopoiesis is still unknown. We have previously demonstrated that the inflammasome plays an important role in erythropoiesis through the direct cleavage of the master erythroid transcription factor GATA1 by its main effector caspase-1 (CASP1). Fine tuning of GATA1 protein level by the inflammasome determines both erythroid-myeloid decision of hematopietic stem and progenitor cells (HSPCs) and terminal erythroid differentiation. This mechanism is conserved in zebrafish, mouse, and human. Using the unique advantages of the zebrafish model for genetic and pharmacological screening in combination with biochemical and functional studies in human erythroleukemic K562 cells, we report here that pharmacological inhibition of caspase-1 rescued the hematopoietic alterations of zebrafish models of neutrophilic inflammation and Diamond-Blackfan anemia (DBA). In addition, we have identified that the NLRP1 inflammasome is the one responsible for the regulation hematopoiesis via the regulation of erythroid-myeloid lineage decision of HSPCs. Thus, inhibition of Nlrp1 in zebrafish resulted in a reduced number of neutrophils and macrophages, and a concomitant increased erythrocyte count, while the emergency of HSPCs was unaffected. Furthermore, inhibition of the Nlrp1 inflammasome also alleviated neutrophilia in a zebrafish model of neutrophilic inflammation. The crosstalk between inflammasome and hematopoiesis has clinical implications, since chronic inflammatory diseases are usually associated to hematopoietic lineage bias, including neutrophilia and anemia. For this reason, we have performed an FDA/EMA-approved compound screening to identify NLRP1 inhibitors. We have found that spironolactone specifically inhibited NLRP1 inflammasome in HEK293T cells and, more importantly, it facilitated erythroid differentiation of K562 cells and human primary HSPCs, and phenocopied the effects of genetic inhibition of Caspa (caspase a, the functional analogue of mammalian caspase-1) and Nlrp1 in zebrafish. Furthermore, it is important to highlight that spironolactone robustly alleviated the impaired erythropoiesis of HSPCs from a DBA patient with the common mutation in RSP19 and, strikingly, without affecting myelopoiesis. Since spironolactone is an FDA/EMA-approved drug, it is attractive for repurposing in the treatment of DBA. Another important issue that needs to be clarified is the mechanism of action of spironolactone, since its analogue eplerenone failed to inhibit the NLRP1 inflammasome and to regulate hematopoiesis. Consequently, it is crucial to know if the structural differences between these two compounds determine their different activity on NLRP1 inflammasome. Finally, we report an additional level of regulation within this crosstalk, involving a GATA switch (GATA1 displaces GATA2) that occurs at a primate conserved sequence located at the intron 7 of CASP1 gene upon induction of erythroid differentiation. Deletion of the binding sites of GATA present in this sequence by CRISPR-Cas9 technology in human erythroleukemic K562 cells facilitates terminal erythroid differentiation. Luciferase reporter assays revealed that this sequence showed promoter activity, which was negatively regulated by GATA1, and drove transcription of a short transcript in both K562 and CD34+ HSPCs encoding a 6 kDa polypeptide, which was stabilized upon erythroid differentiation. Therefore, additional experiments must be performed to illuminate the mechanism of action of the transcript and whether it encodes a protein or rather acts as a non-coding RNA.