Respuesta de las neuronas retinianas a la lesión y su neuroprotección : caracterización de las células ganglionares alfa de la retina

Abstract

Introducción: Las lesiones del sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos adultos causan, en la mayoría de los casos, daños irreparables y permanentes. El sistema visual y, en particular, la retina se utiliza a menudo como modelo para estudiar los procesos neurodegenerativos subyacentes a la fisiopatología del SNC, pero no siempre se dispone de las herramientas necesarias. Objetivos: Aquí proponemos una nueva herramienta para estudiar el flujo de calcio intracelular en las células bipolares de la retina (CB). También caracterizamos las células ganglionares retinianas alfa (CGRα) en la retina pigmentada de ratón y estudiamos la supervivencia de estas células en un modelo de sección intraorbitaria del nervio óptico (SNO) y excitotoxicidad inducida por la administración intravítrea de ácido N-metil-D-aspártico (NMDA). En estos modelos, evaluamos los efectos neuroprotectores de la administración sistémica de las moléculas 7,8-Dihidroxiflavona (DHF), que es un potente agonista del receptor TrkB, ITH12657, que es un bloqueante selectivo del canal calcio dependiente de voltaje, e ITH15004, que es un antagonista selectivo del receptor P2X7. Además, caracterizamos un modelo de hipertensión ocular aguda (HTOA) en la rata albina adulta y el ratón pigmentado. Analizamos las vías de muerte celular implicadas tras la HTOA y los efectos protectores de las moléculas DHF, ITH12657 e ITH15004. Materiales y métodos: Para estudiar el flujo de Ca2+ intracelular inyectamos el virus AAV2.Ple265.GCaMP6f.WPRE y analizamos los cambios que se producían en los terminales axonales de las células bipolares tras la iluminación in vivo con microscopía de 2 fotones. Para estudiar los efectos en la retina de SNO, NMDA o HTOA y su protección utilizamos técnicas in vivo como el electrorretinograma de campo completo (ERG) y la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) y técnicas ex vivo como la inmunohistoquímica y la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Resultados: i) el AAV2.Ple265. GCaMP6f es una buena herramienta para estudiar el flujo de calcio en los terminales CB, y se pudo observar que los microdominios de un mismo terminal no responden igual al mismo estímulo luminoso; ii) las CGRα representan el 5,23% de la población de CGR en la retina de ratones pigmentados. Las CGRα que responden a la luz de forma sostenida son más frecuentes en el cuadrante temporal superior, mientras que las que responden de forma transitoria pueblan principalmente la parte media-periférica de la retina; iii) la HTOA causa daños permanentes y severos tempranamente en la retina interna y posteriormente en la retina externa. Cursa con 6 tipos de muerte celular y la combinación de DHF, ITH12657 e ITH15004 previene la degeneración retiniana; iv) la excitotoxicidad NMDA provoca una degeneración desigual en los subtipos CGRα. Mientras que las CGRα-OFF casi desaparecen tras la excitotoxicidad NMDA, las CGRα-ONt no se ven afectadas, y la población de CGRα-ONs se reduce en un 73%. El ITH12657 rescata las CGRα-ONs hasta 21 días y la DHF hasta 7 días; v) la SNO resulta en una desaparición casi completa de la población CGRα-OFF y en la pérdida del 75% de las CGRα-ONs. La DHF rescata el 66% de las CGRα-ON hasta los 14 días y mejora la funcionalidad de las CGR hasta los 21 días. Conclusiones: La información visual que es percibida por una única célula bipolar de cono se clasifica en sus terminales axonales. Las CGRα representan el 5,2% de la población total de CGR de ratones pigmentados, y presentan diferente resiliencia dependiendo del subtipo y del tipo de lesión. Las moléculas DHF, ITH12657 e ITH15004 muestran efectos beneficiosos en los modelos de lesión retiniana de SNO, HTOA o NMDA y podrían utilizarse en el futuro para tratar el glaucoma.

Introduction: Injury to the central nervous system (CNS) of the adult mammal cause, in most instances, unrepairable and permanent damage. The visual system and, in particular, the retina is often used as suited model to study the neurodegenerative processes underlying CNS pathophysiology, but the necessary tools are not always available. Objectives: Here we propose a new tool to study intracellular calcium flux in retinal bipolar cells (BCs). We also characterize alpha retinal ganglion cells (αRGC) in the pigmented mouse retina and study the survival of these cells in a model of intraorbital complete optic nerve transection (ONT) and excitotoxicity induced by intravitreal administration of N-methyl-D-aspartic acid (NMDA). In these models, we evaluated the neuroprotective effects of the systemic administration of the molecules 7,8-Dihydroxyflavone (DHF) which is a potent agonist of the TrkB receptor, ITH12657 which is a mild calcium voltage channel blocker, and ITH15004 which is a mild and selective P2X7 receptor antagonist. In addition, we characterize a model of acute ocular hypertension (AOH) in the adult albino rat and pigmented mouse. We analyze the cell death pathways involved following AOH and the protective effects of the molecules DHF, ITH12657 and ITH15004. Materials and methods: To study Ca2+ influx we injected AAV2.Ple265.GCaMP6f.WPRE virus and analyzed the changes that occurred in the axonal terminals of bipolar cells (BC) after illumination in vivo with 2-photon microscopy. To study the effects on the retina of ONT, NMDA or AOH and its protection we used in vivo techniques such as full-field electroretinogram (ERG) and spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) and ex vivo techniques such as immunohistochemistry and quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Results: i) AAV2.Ple265. GCaMP6f is a good tool to study calcium flux in CB terminals, and it was possible to observe that microdomains of the same terminal do not respond equally to the same light stimulus; ii) αRGC represent 5.23% of the pigmented mouse population of RGCs, those that respond to light in a sustained manner are more frequent in the superior temporal quadrant while those that respond transiently populate mainly the mid-peripheral part of the retina; iii) OHT causes permanent and severe damage early in the inner retina and later in the outer retina. It courses with 6 types of cell death and the combination of DHF, ITH12657 and ITH15004 prevents retinal degeneration; iv) NMDA excitotoxicity causes unequal degeneration in αRGC subtypes. While the αRGC-OFF almost disappear after NMDA excitotoxicity, αRGC-ONt are not affected, and the population of αRGC-ONs is depleted by 73%. ITH12657 rescues αRGC-ONs up to 21 days and DHF up to 7 days; v) ONT results in an almost disappearance of the αRGC-OFF population and in the loss of 75% of the αRGC-ONs. DHF rescues 66% of the αRGC-ONs up to 14 days and improves RGC functionality up to 21 days. Conclusions: Visual information that is perceived by a single cone bipolar cell is sorted at its axonal terminals. αRGCs represent 5.2% of the total pigmented mice RGC population, and present different resilience depending on the subtype and the kind of injury. The molecules, DHF, ITH12657 and ITH15004 exhibit beneficial retinal effects in the retinal injury models of ONT, OHT or NMDA and could potentially be used in the future to treat glaucoma.