Identificación de polimorfismos en genes relevantes para la implantación y el desarrollo embrionario

Abstract

• Antecedentes y objetivos: Con la incorporación de las técnicas de reproducción asistida para tratar el problema de la infertilidad humana, surge el reto de combatir la pérdida de embarazo temprano. El embrión juega un papel clave en la eficiencia de la implantación que, unido a la necesidad de reducir el número de embriones a transferir, conduce por un lado a la mejora de las condiciones de cultivo y desarrollo embrionario, y por otro, al avance de las técnicas de selección embrionaria. Con este último propósito, el objetivo principal de esta tesis ha sido la identificación de polimorfismos (SNPs) propios del embrión relacionados con la infertilidad, susceptibles de convertirse en biomarcadores genéticos. Posteriormente, los resultados obtenidos fueron integrados en un sistema de Inteligencia Artificial (IA), junto con otros parámetros derivados del ciclo reproductivo de los pacientes, con el objeto de crear una herramienta de selección embrionaria capaz de predecir el éxito de la implantación y el desarrollo embrionario temprano. • Métodos: Se elaboró primeramente un panel compuesto por 27 genes cuyos SNPs podrían influir en el desarrollo embrionario humano y estar relacionados con el fallo de implantación y muerte embrionaria temprana, teniendo en cuenta el fenotipo que presentan modelos KO de ratón estudiados previamente para esos genes. El panel seleccionado ha sido investigado en 134 muestras de ADN procedentes de biopsia de trofoectodermo de embriones euploides. Los embriones procedían de un tratamiento de ICSI con PGT-A, y su destino era la transferencia uterina, tras la cual se realizó el seguimiento gestacional hasta el nacimiento. Para llevar a cabo la secuenciación masiva de las muestras de ADN y el análisis bioinformático de los resultados, se utilizó la metodología de Ion Torrent. Posteriormente, se estudiaron las secuencias proteicas, características estructurales y funcionales de las proteínas, así como los fenotipos asociados utilizando las bases de datos disponibles (Uniprot, GeneCards, Ensembl, MGI, ClinVar y OMIM). Se procedió a la identificación de SNPs deletéreos considerando la mutación existente, genotipo, localización del gen, posible efecto dañino y prevalencia en la población, comparando estos datos con los resultados clínicos obtenidos de la transferencia embrionaria y su posterior evolución. Finalmente, todos los datos fueron integrados en un sistema de IA, junto con otros relativos al ciclo reproductivo de los pacientes, edad, procedencia de los gametos, morfología y cinética de los embriones. • Resultados y conclusiones: Tras la evaluación de los SNPs se identificaron varios genes que podrían estar implicados en el desarrollo embrionario temprano y/o el periodo periimplantacional humano, entre ellos: RAE1, F2 y GDF3. De ellos se han detectado 3 SNPs con posible efecto deletéreo en homocigosis del gen F2: chr11:46749646C>T, chr11:46750236A>T y chr11:46751102T>A; y otros dos en heterocigosis de los genes RAE1, chr20:55941902C>*, y GDF3, chr20:55941902C>*. El diseño del panel ha sido esencial para su identificación, y tras la verificación correspondiente, estos SNPs podrían ser utilizados como biomarcadores de fallo postimplantacional. La identificación de la mutación generada de novo en el gen PIKFYVE, chr2:209179025A>*, pone de manifiesto la necesidad de verificar el genotipo embrionario mediante PCR convencional y secuenciación de Sanger. En cuanto al sistema de IA, el algoritmo basado en el árbol de toma de decisiones ha sido el más adecuado, ocupando la meta-variable genética PC1 la segunda posición entre las más representativas. La aplicación de la IA presenta resultados esperanzadores, aunque, al igual que con la identificación de SNPs deletéreos, es necesario aumentar el número de muestras a analizar para obtener resultados y conclusiones más relevantes.

• Background and objectives: The use of Assisted Reproduction Treatments in human fertility brings the challenge of combating early pregnancy loss. The embryo plays a key role in the efficiency of implantation which, together with the need to reduce the number of embryos to be transferred, leads, on the one hand, to the improvement of culture conditions and embryonic development, and, on the other, to the advancement of embryo selection techniques. Following the latter, the main object for this project was to identify embryo polymorphisms (SNPs) related to infertility, in order to use them as biomarkers. Secondary, the results obtained were integrated into an Artificial Intelligent (AI) system adding extra data from the reproductive cycle of the recruited patients, with the aim of creating a tool for embryo selection, able to predict the success of embryo implantation and early embryonic development. • Methods: First, a panel composed of 27 genes, whose SNPs could be involved in human embryonic development, implantation failure and early embryonic loss was created. The genetic profile of those genes had previously been reported in mouse knock-out models. The selected panel was researched in 134 DNA samples from trophectoderm biopsies of euploid embryos. The embryos came from an ICSI treatment with PGT-A, and their destination was uterine transfer, while the gestational evolution was followed up until birth. To carry out the massive sequencing of the DNA samples and the bioinformatics analysis of the results, the Ion Torrent technology was used. The sequences, structural and functional characteristics of the proteins, as well as the associated phenotypes were studied using the available databases (Uniprot, GeneCards, Ensembl, MGI, ClinVar and OMIM). We proceeded to identify deleterious SNPs, considering the mutation, genotype, location of the gene, the possible harmful effect and its prevalence in the population. We compared these results with the clinical ones obtained from the embryo transfer and follow-up evolution. Finally, all the data was integrated into an AI system, together with other data which belongs to the reproductive cycle of the patients, age, origin of gametes, morphology and kinetics of the embryos.

• Results and Conclusions: After evaluating the SNPs, several genes that could be involved in human early embryonic development and/or the peri-implantation period were identified. These included RAE1, F2 and GDF3. From them, three SNPs with a possible deleterious effect have been detected in homozygotes on F2: chr11:46749646C>T, chr11:46750236A>T and chr11:46751102T>A; another two were heterozygous on RAE1: chr20:55941902C>*, and GDF3: chr20:55941902C>*. The panel design has been a key to identify them, and after verification, these polymorphisms could be used as biomarkers for embryonic post implantation failure. The novo mutation that was identified on PIKFYVE (chr2:209179025A>*) shows the necessity to verify the embryo genotype using conventional PCR and Sanger sequencing. Regarding the AI model, the algorithm based on the decision-making tree has been the best choice, and the genetic meta-variable PC1 being in second place amongst the most representative. Results using AI systems brings hope, although, as well as deleterious SNPS identification, the need of increasing the number of tested samples to obtain further representative conclusions is required.