Functional role of microRNAs in acute coronary syndrome patients younger than 45 years old

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en Europa con aproximadamente 4 millones de muertes en 2021. Siendo la enfermedad cardiovascular más frecuente el infarto agudo de miocardio, una de las presentaciones clínicas del síndrome coronario agudo (ACS). Los pacientes menores de 45 años representan alrededor del 6% del total, presentan sus propios factores de riesgo y manifestaciones clínicas, convirtiéndose en un grupo muy diferenciado de pacientes, incluso un 20% de estos pacientes jóvenes no presenta aterosclerosis. El diagnóstico rápido y preciso es crucial para el manejo clínico de los pacientes con ACS. Con la aparición de la enfermedad se liberan diversos factores a la sangre que pueden utilizarse como potenciales biomarcadores. En el caso de los pacientes jóvenes, es especialmente útil encontrar nuevos biomarcadores pronósticos y predictivos.

Objetivos: Estudiar si el ACS en pacientes jóvenes es una enfermedad tromboinflamatoria e identificar nuevas variantes genéticas en genes de microRNA que puedan servir como biomarcadores de tromboinflamación, desarrollo y recurrencia de la enfermedad en pacientes jóvenes. Objetivo 1: Estudiar la asociación del genotipo para rs2431697 de miR-146a con el desarrollo clínico de los pacientes jóvenes con ACS a través de la producción excesiva de trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Objetivo 2: Investigar si la sobreexpresión del factor tisular en respuesta a los componentes de los NET, histonas y DNA, está regulada por microRNA. Objetivo 3: Identificar nuevas variantes en genes de microRNA con un potencial rol patológico en el desarrollo de ACS.

Material y métodos: Para alcanzar estos objetivos se dispuso de muestras de plasma de pacientes de ACS menores de 45 años en el momento del primer evento, recogidas de manera retrospectiva, así como de controles sanos. Para el estudio experimental, se realizaron cuantificaciones en el plasma, tanto de DNA libre (cfDNA) como de Histona H3 citrulinada en colocalización con DNA (citH3-DNA). Para la realización de experimentos in vitro se utilizaron cultivos celulares como HepG2, THP-1 y EA.hy926. También se llevaron a cabo diversas técnicas de biología molecular como extracción de ácidos nucleicos, RT-qPCR, NGS y edición génica por CRISPR-Cas9. Los datos obtenidos se analizaron empleando en cada caso las pruebas estadísticas más adecuadas.

Resultados: 1. Los marcadores de NET se encuentran significativamente aumentados en los pacientes jóvenes de ACS en comparación con los donantes sanos. Los pacientes portadores del alelo T de rs2431697 tienen unos niveles significativamente mayores de cfDNA y de complejos citH3-DNA en comparación con los pacientes CC. Por último, se encontró que aquellos pacientes, del grupo con recurrencia, con los niveles de NET en plasma por encima de la mediana, portadores del alelo T, presentaban un mayor riesgo de sufrir eventos isquémicos recurrentes. 2. Histona H4 y, en menor medida, DNA provocan un aumento en la expresión de diversos factores de la coagulación. Además, ambos activadores provocan un aumento en la expresión de HNF4A. Por último, se demostró que la histona H4 puede producir una disminución de la expresión de algunos microRNA del cluster miR-17-92, explicando en parte la regulación de la expresión de factor tisular provocada por la H4, mientras que el DNA actuaría de manera independiente a miR-17-92. 3. Se encontraron dos variantes de un solo nucleótido (SNV) presentes en una frecuencia significativamente más alta en pacientes de ACS que en controles sanos, ambas localizadas en la zona de genes de microRNA que han sido previamente relacionados con enfermedades cardiovasculares. Demostrando un potencial rol como marcador pronóstico genético de la enfermedad.

Conclusiones: Este proyecto aporta nueva y valiosa información sobre el papel de los microRNA y sus variantes genéticas en el ACS como biomarcadores de la severidad y desarrollo de la enfermedad, e incluso como efectores funcionales de la misma. 1. Los marcadores plasmáticos de NET son un marcador útil de ACS en pacientes jóvenes. El alelo T de rs2431697 puede actuar como un factor de riesgo adicional para el peor pronóstico en estos pacientes. 2. La histona H4 puede disminuir la expresión de algunos microRNA del cluster miR-17-92, explicando la regulación que provoca sobre el factor tisular. El DNA también regula la expresión de factor tisular, pero independientemente de miR-17-92. 3. Analizamos por primera vez la presencia de mutaciones en genes de microRNA relacionados con el ACS, describiendo dos SNV presentes en una frecuencia significativamente mayor en los pacientes jóvenes que en los controles sanos

Cardiovascular diseases are the main cause of death in Europe with approximately 4 million deaths in 2021. The most frequent cardiovascular disease is acute myocardial infarction, one of the clinical presentations of acute coronary syndrome (ACS). Patients under 45 years of age represent around 6% of the total, present their own risk factors and clinical manifestations, becoming a highly differentiated group of patients, even 20% of these young patients do not present atherosclerosis. Prompt and accurate diagnosis is crucial for the clinical management of patients with ACS. With the onset of the disease, various factors are released into the blood that can be used as potential biomarkers. In the case of young patients, it is especially useful to find new prognostic and predictive biomarkers.

Objectives: To study whether ACS in young patients is a thromboinflammatory disease and to identify new genetic variants in microRNA genes that may serve as biomarkers of thromboinflammation, disease development, and recurrence in young patients. Objective 1: To study the association of the miR-146a rs2431697 genotype with the clinical development of young ACS patients through excessive production of neutrophil extracellular traps (NETs). Objective 2: To investigate whether the overexpression of tissue factor in response to NET components, histones and DNA, is regulated by microRNA. Objective 3: Identify new variants in microRNA genes with a potential pathological role in the development of ACS.

Material and methods: To achieve these objectives, we retrospectively collected plasma samples from ACS patients under 45 years of age at the time of the first event, as well as from healthy controls. For the experimental study, plasma quantifications were performed, both of free DNA (cfDNA) and of citrullinated Histone H3 in colocalization with DNA (citH3-DNA). To carry out in vitro experiments, cell cultures such as HepG2, THP-1 and EA.hy926 were used. Various molecular biology techniques such as nucleic acid extraction, RT-qPCR, NGS and gene editing by CRISPR-Cas9 were also carried out. The data obtained were analyzed using the most appropriate statistical tests in each case.

Results: 1. NET markers are significantly increased in young ACS patients compared to healthy donors. Patients carrying the T allele of rs2431697 have significantly higher levels of cfDNA and citH3-DNA complexes compared to CC patients. Finally, it was found that the patients in the recurrence group with plasma NET levels above the median and carriers of the T allele, had a higher risk of suffering recurrent ischemic events. 2. Histone H4 and, to a lesser extent, DNA cause an increase in the expression of various coagulation factors. Furthermore, both activators cause an increase in the expression of HNF4A. Finally, it was shown that histone H4 can cause a decrease in the expression of some miR-17-92 cluster microRNAs, partly explaining the regulation of tissue factor expression caused by H4, whereas DNA would act independently of miR-17-92. 3. Two single nucleotide variants (SNVs) were found to be present at a significantly higher frequency in ACS patients than in healthy controls, they were both located in the area of microRNA genes that have been previously associated with cardiovascular disease. Demonstrating a potential role as a genetic prognostic marker of the disease.

Conclusions: This project provides new and valuable information on the role of microRNAs and their genetic variants in ACS as biomarkers of the severity and development of the disease, and even as functional effectors. 1. Plasma NET markers are a useful marker of ACS in young patients. The T allele of rs2431697 may act as an additional risk factor for the worse prognosis in these patients. 2. Histone H4 can decrease the expression of some microRNAs of the miR-17-92 cluster, explaining the regulation it causes on tissue factor. DNA also regulates tissue factor expression, but independently of miR-17-92. 3. We analyzed for the first time the presence of mutations in microRNA genes potentially related to ACS, describing two SNVs present at a significantly higher frequency in young patients than in healthy controls, both located within the gene of a miRNA described to be involved in cardiovascular diseases.