Role of oxidative stress in melanoma and steatohepaititis

Abstract

Durante el desarrollo de esta Tesis, utilizamos modelos de pez cebra para estudiar el impacto de la Dual Oxidasa 1 (Duox1) y la Xantina deshidrogenasa (Xdh), dos de las principales enzimas que contribuyen al estrés oxidativo, durante la progresión del melanoma y la esteatohepatitis. En el primer capítulo, describimos un papel dual de DUOX1 en el melanoma. Descubrimos que los niveles de transcripción de DUOX1 altos, pero no bajos, en el melanoma temprano se asocian con una supervivencia deficiente del paciente, mientras que no se observaron diferencias estadísticamente significativas en la supervivencia del paciente con melanoma en estadíos tardíos. Además, se observaron vías de señalización alteradas involucradas en el sistema inmunitario, la activación del complemento y el rechazo de aloinjertos en melanomas que expresan niveles bajos de DUOX1, lo que sugiere la importancia del equilibrio del estrés oxidativo en la progresión del melanoma. Aunque no encontramos ningún efecto significativo de esta enzima en la transformación de los melanocitos y la progresión temprana del melanoma, los experimentos de alotrasplante en receptores de pez cebra inmunocomprometidos revelaron que las células de melanoma deficientes en Duox1 mostraron un crecimiento reducido, pero paradójicamente, generaron más metástasis que el control. La relevancia de DUOX1 en melanoma y en enfermedades inflamatorias crónicas de la piel apuntan a DUOX1 como diana farmacológica. Así, generamos una línea celular de melanoma que sobreexpresa tanto DUOX1 como su factor de maduración DUOXA1, para realizar un cribado farmacológico para encontrar activadores o inhibidores específicos de esta enzima. Entre 256 medicamentos aprobados por la FDA/EMA, identificamos varios candidatos prometedores que requerían validación. En el segundo capítulo estudiamos el papel que juega Xdh en el desarrollo de la esteatohepatitis. Observamos acumulación de lípidos y aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el hígado de larvas alimentadas con una dieta alta en colesterol (HCD), además de características histológicas hepáticas relacionadas con la enfermedad del hígado graso no alcohólico/esteatohepatitis no alcohólica (NAFLD/NASH) en humanos, como la acumulación de lípidos en gotas y la dilatación de los hepatocitos. El análisis proteómico de hígados de larvas alimentadas con HCD mostró una regulación a la baja de varias enzimas que participan en las rutas de biosíntesis de colesterol y lípidos. Es importante destacar que la deficiencia de Xdh mejoró la progresión de la enfermedad al disminuir todas estas alteraciones patológicas asociadas con la progresión de NASH. Una de las observaciones más interesantes de nuestro estudio es que la deficiencia de Xdh pudo mejorar la progresión de NASH en larvas alimentadas con HCD y promover la regulación a la baja de las vías metabólicas de los lípidos, incluida la degradación de ácidos grasos, el metabolismo del retinol y el metabolismo de los glicerolípidos, y la regulación positiva de la fosforilación oxidativa. En general, todos estos resultados respaldan que Xdh está involucrado en la progresión de la enfermedad de NAFLD, lo que explica la asociación encontrada entre XDH y NAFLD en varios estudios clínicos, y señala la relevancia del modelo de larva de pez cebra alimentado con HCD para identificar nuevas vías de señalización asociadas con NAFLD/NASH en humanos.

During the development of this Thesis, we used zebrafish models to study the impact of Dual Oxidase 1 (Duox1) and Xanthine dehydrogenase (Xdh), two major oxidative stress contributing enzymes, during the progression of melanoma and steatohepatitis. In the first chapter, we report a dual role of DUOX1 in melanoma. We found that high, but not low, DUOX1 transcript levels in early melanoma are associated with poor patient survival, while no statistically significant differences in patient survival were observed in late melanoma. In addition, altered signaling pathways involved in immune system, complement activation and allograft rejection were observed in melanoma expressing low levels of DUOX1, suggesting the importance of oxidative stress balance in melanoma progression. Although we did not find any significant effect of this enzyme in melanocyte transformation and early melanoma progression, allotransplantation experiments in immunocompromised zebrafish recipients revealed that Duox1-deficient melanoma cells showed decreased growth but, paradoxically, generated more metastasis than control. The relevance of DUOX1 in melanoma and in skin chronic inflammatory diseases, point to DUOX1 as a pharmacological target. So, we generated a melanoma cell line that overexpresses both DUOX1 and its maturation factor DUOXA1, to perform pharmacological screening to find specific activators or inhibitors of this enzyme. Among 256 FDA/EMA-approved drugs, we identified several promising candidates that required validation. In the second chapter, we studied the role played by Xdh in steatohepatitis development. We observed accumulation of lipids and increased reactive oxygen species (ROS) production in the liver of larvae fed with high cholesterol diet (HCD), concomitant with liver histological features related with Non-Alcoholic Fatty Liver Disease/Non-Alcoholic Steatohepatitis (NAFLD/NASH) in humans, such as accumulation of lipid droplets and ballooning of hepatocytes. Proteomic analysis of livers of wild type larvae fed with HCD showed downregulation of several enzymes which participates in the cholesterol and lipid biosynthesis pathways. Importantly, Xdh deficiency ameliorated the progression of the disease by decreasing all these pathological alterations associated to NASH progression. One of the most interesting observations of our study is that Xdh deficiency was able to ameliorate NASH progression in larvae fed with HCD and, concomitantly, to promote the downregulation of lipid metabolic pathways, including fatty acid degradation, retinol metabolism and glycerolipid metabolism, and the upregulation of oxidative phosphorylation. Overall, all these results support that Xdh is involved in NAFLD disease progression, explaining the association found between XDH and NAFLD in several clinical studies, and point out to the relevance of the zebrafish larval model fed with HCD to identify novel signaling pathways associated with NAFLD/NASH in humans.