Telomerase RNA component, terc, in aging and cancer

Abstract

Actualmente, existe gran interés en el estudio del envejecimiento, para mejorar la esperanza de vida y su calidad, ya que existen enfermedades asociadas, incluyendo el cáncer. La longitud de los telómeros, que constituyen los extremos de los cromosomas, y la enzima telomerasa, que mantiene la longitud telomérica, están directamente relacionados con este proceso. Se han descrito funciones no canónicas para sus componentes principales, la subunidad catalítica, TERT, y el componente de ARN, TERC, que tiene una función en la mielopoyesis. Los estudios sobre telomerasa, telómeros y envejecimiento usando el pez cebra como modelo son cada vez más numeroso gracias a la similitud en cuanto a longitud telomérica y la conservación con el humano en secuencia y estructura de los componentes de la telomerasa,. Su uso como modelo de enfermedades humanas y cáncer está muy extendido, habiéndose desarrollado numerosos modelos de leucemia y enfermedades hematopoyéticas. Durante el Desarrollo de esta Tesis Doctoral, hemos usado el pez cebra para estudiar el efecto de la deficiencia en el componente de ARN de la telomerasa, terc, en envejecimiento, hematopoyesis y proliferación de células mieloides. Los objetivos principales son: caracterización del fenotipo de envejecimiento y la hematopoyesis de una línea de pez cebra mutante para el componente de ARN de la telomerasa y; desarrollo y caracterización de un modelo de proliferación de células mieloides. Para ello, se usaron técnicas de mantenimiento y manipulación del pez cebra, incluyendo disección, genotipado, puesta de cruces, estudio de la supervivencia, técnicas de histología y citología, etc. También técnicas de biología celular y molecular. Entre ellas destacan, el análisis de la expresión génica, medida de actividad telomerasa, técnicas de hibridación in situ, citometría de flujo, tinción de embriones de pez cebra para medir senescencia, técnicas de marcaje de líneas celulares en embriones de pez cebra, etc. En este estudio se muestra como terc se expresa desde etapas tempranas del desarrollo del pez cebra y tiene un patrón de expresión característico en cada tejido en el pez adulto. La caracterización de la línea mutante en terc mostró la ausencia de actividad telomerasa, tanto en embriones como en el adulto, lo que conduce a un acortamiento de los telómeros, lo que lleva a una reducción de la vida media y la aparición de un fenotipo de envejecimiento prematuro en la primera generación. Los embriones deficientes en terc mostraron defectos en la hematopoyesis, concretamente en la mielopoyesis, defectos que n se observaron en el modelo adulto. Así, este modelo ayudará al estudio de funciones del componente de ARN de la telomerasa en envejecimiento y cáncer, y de sus posibles funciones no canónicas. En el caso de la segunda generación de la línea, no puede alcanzar el desarrollo hasta adulto y presenta marcadores de envejecimiento a cortos periodos de tiempo, como la senescencia celular, haciendo de ella un buen modelo para el escrutinio de fármacos anti-envejecimiento. Por último, se ha desarrollado un modelo en el que el oncogén humano HRAS mutado, se expresa específicamente en neutrófilos, que muestra dispersión y proliferación de los mismos en embriones y larvas, fenotipo que mejora en condiciones de deficiencia de terc, pero no de tert. Los peces adultos de este modelo no muestran signos de desarrollo de leucemia, sin embargo, muestran una vida media reducida y desarrollan tumores sólidos de carácter benigno y origen no mieloide.

Nowadays there is a great interest in delaying the process of aging to improve life expectancy and quality, mainly due to the associated diseases that emerge with it, including cancer. It is extensively known that telomerase and telomeres are involved in the aging process, as telomere attrition is one of the primary hallmarks of aging, among others. Cancer is an important disease that is not exclusively associated with aging, and its initiation and progression depend on many genetic and environmental factors. The telomerase enzyme is directly related with aging and cancer because of its function in telomere maintenance, but also, many non-canonical functions are being described for its two main components, telomerase catalytic subunit (TERT) and telomerase RNA (TERC), being a remarkable one the non-canonical function that TERC has in myelopoiesis. With the increasing interest of using the zebrafish as an animal model, studies about telomeres and telomerase in this species have emerged due to similar telomere length and conservation regarding telomerase components. Also, since the zebrafish has been widely used for disease modelling, it has a great importance in the cancer field. Importantly, the zebrafish has been also used to model leukemia and myeloid malignancies. During the development of this Doctoral Thesis we used the zebrafish animal model to study the effect of the RNA component of telomerase deficiency on aging, hematopoiesis and myeloid proliferation driven by an oncogene. So, that mains objectives were the characterization of the zebrafish terc mutant line aging and hematopoietic phenotypes, and also, the development and characterization of a zebrafish myeloid proliferation model using oncogene expression. For these purposes, we used and manipulated the zebrafish animal model, including maintenance, breeding, and dissecting and also applied many cellular and molecular biology techniques. These include, gene expression analysis, measurement of telomerase activity, in situ hybridization techniques, flow cytometry, histology and cytology techniques, staining on whole zebrafish embryos to label specific cellular lineages, survival analysis, etc. First, we show that terc is expressed from early stages of development and has different expression levels depending on the tissue of adult fish. Next, the terc mutant zebrafish line study concluded that this line has an increased telomere shortening due to absence of telomerase activity, presents premature aging signs and a reduced lifespan in the first generation. Also, terc deficient zebrafish larvae showed hematopoietic defects that affect myelopoiesis, which is not observed in adult fish. This model will help investigate terc roles in aging and cancer, as well as non-canonical functions. Second-generation terc-deficient zebrafish cannot reach adult stage and present aging hallmarks at very short time points, making it a very adequate model for anti-aging drug screening. We developed a model of hyperactivated human HRAS oncogene expression in neutrophils that showed neutrophil expansion and dispersion phenotype that can be ameliorated in terc, but not tert, deficiency conditions. Adult zebrafish model does not show myeloid malignancy signs or leukemia development. Nevertheless, this model has a reduced lifespan and develop a wide range of solid tumors with benign nature.