Desarrollo de bio-nanoencapsulaciones para la mejora de la estabilidad y biodisponibilidad de ingredientes bioactivos de crucíferas

Abstract

Las crucíferas son uno de los cultivos con mayor repercusión a nivel mundial, debido a que sus distintos órganos son comestibles y sus semillas pueden emplearse para obtener aceite. Destacan los cultivos de Brassica oleracea L., por su bajo contenido en grasas, su alta proporción de agua y una gran diversidad de vitaminas y minerales. Asimismo, presentan un elevado contenido en fitoquímicos, como los glucosinolatos, beneficiosos para la salud. Éstos son un grupo de metabolitos secundarios, pertenecientes a los vegetales de la familia de las crucíferas y derivados de aminoácidos. No obstante, estos compuestos no presentan bioactividad, necesitando ser hidrolizados por la enzima mirosinasa, proporcionando distintas moléculas bioactivas como los isotiocianatos. Concretamente, se ha demostrado que los isotiocianatos presentan diversas actividades como anti-proliferativos, antioxidantes y antiinflamatorios. De este modo, es de gran interés poder modular la acumulación de glucosinolatos de manera exógena, obteniendo así vegetales con un valor añadido. El uso de elicitadores como el metil jasmonato o el ácido salicílico ha sido ampliamente estudiado en cultivos como el brócoli, pero los protocolos a emplear en nuevas variedades hibridas, como el Bimi®, o en variedades poco estudiadas, como la col lombarda, aún se desconocen. Además, la obtención de un material de origen enriquecido en glucosinolatos es altamente beneficioso para la elaboración de formulaciones con una alta concentración de isotiocianatos, las cuales presentan un gran interés para la industria alimentaria. No obstante, los isotiocianatos son moléculas cuya estabilidad y afinidad en medio acuoso depende de sus características fisicoquímicas, por lo que el uso de nanoportadores favorece su estabilidad a largo plazo. Ante ello, en la presente Tesis Doctoral, se han empleado membranas de origen vegetal (Brassica oleracea L. var. botrytis o coliflor) con el fin de aumentar la biodisponibilidad de las formulaciones y encontrar una materia prima sostenible y biodegradable. Por todo lo expuesto anteriormente, la presente Tesis Doctoral plantea el desarrollo y elaboración de formulaciones bioactivas, obtenidas a partir de material vegetal previamente elicitado en campo de plantas adultas de Bimi® y col lombarda, y estabilizados mediante agentes nanoencapsulantes procedentes de membrana plasmática de coliflor, para, posteriormente, estudiar su bioaccesibilidad y bioactividad en modelos de obesidad. De este modo, se determinó la relación clave entre elicitador y especie, encontrando resultados óptimos para la acumulación de glucosinolatos indólicos y alifáticos en Bimi® con la combinación de ácido salicílico y metil jasmonato. Con respecto a la col lombarda, la aplicación de metil jasmonato fue la que proporcionó el mayor aumento de glucosinolatos. En cuanto a la obtención de formulaciones, la extracción óptima de glucosinolatos de Bimi® se determinó entre los 15 y 30 minutos de hidrodestilación, según el órgano vegetal empleado. Asimismo, la adición de vesículas de coliflor (90d ICVs) como agentes nanoencapsulantes no alteró la composición de isotiocianatos presentes en las formulaciones. Con respecto a la caracterización de las 90d ICVs, revelaron un alto grado de insaturación de ácidos grasos que, junto con la presencia de sitosterol, aportan una mayor permeabilidad al agua a la bicapa lipídica de las vesículas. Por otro lado, la elevada presencia de acuaporinas (PIP1 y PIP2) en las 90d ICVs se correlacionó con directamente con los altos valores de permeabilidad osmótica del agua obtenidos. Lo que le confiere al agente nanoencapsulante una alta capacidad de adaptarse a los cambios osmóticos del medio. Estas 90d ICVs favorecieron a conservación de los isotiocianatos durante el proceso de digestión gastrointestinal, favoreciendo la bioaccesibilidad y biodisponibilidad. Finalmente, se observaron diferencias de metabolización con las formulaciones en cultivos de hepatocitos (HepG2) y se analizó un aumento en la producción de ácido butírico en el microbioma intestinal de voluntarios con obesidad.

Cruciferous vegetables are one of the crops with higher repercussion worldwide, since their different parts are edible and their seeds can be used to obtain oil. Specifically, vegetables from Brassica oleracea L. species stand out due to their low content in fatty acids, their elevated water proportion and a high diversity of vitamins and minerals. Furthermore, they show an elevated content in phytochemicals, such as glucosinolates. They are sulphur-derived secondary metabolites, present in cruciferous vegetables and derived from amino acids. However, these compounds do not present bioactivity by themselves, needing to be hydrolysed by the enzyme myrosinase. This results in different bioactive molecules, such as isothiocyanates. It has been reported that isothiocyanates present diverse activities as anti-proliferative, antioxidant and anti-inflammatory compounds. In this way, is highly interesting to modulate the accumulation of glucosinolates by the exogenous application of elicitors, thus, obtaining vegetables with added value. The use of elicitors, such as salicylic acid or methyl jasmonate, has been widely studied in crops like broccoli. However, the protocols for new hybrids like Bimi®, or understudied cruciferous such as red cabbage, have not been already determined. Furthermore, the procurance of a source material enriched in glucosinolates is highly profitable for the elaboration of formulations with an elevated content in isothiocyanates, which are of great interest for the food industry. However, isothicyanates are molecules whose stability and water stability depends on their physicochemical characteristics. In this way, the use of nanocarriers favours its long-term stability. For that purpose, in the present PhD thesis, membranes from vegetal origin (Brassica oleracea L. var. botrytis or cauliflower) have been used with the aim of increasing the bioavailability of the formulations and find a sustainable source material. For all that, the following PhD thesis proposes the development and elaboration of bioactive formulations, obtained from vegetal material previously elicitated in field of Bimi® and red cabbage adult plants, and stabilize them by using nanoencapsulating agents from cauliflower plasma membrane vesicles, for, afterwards, evaluate their bioaccesibility and bioactivity in obesity models. In such manner, the key relation between elicitor and species was determined, finding optimal results for the accumulation of indolic and aliphatic glucosinolates in Bimi® with the combined application of salicylic acid and methyl jasmonate. According to red cabbage, the spraying of methyl jasmonate was the treatment which reported the highest accumulation of glucosinolates. Also, regarding to the formulation elaboration, optimum extraction time was determined between 15 and 30 min, depending on the plant organ used. In addition, the used of cauliflower vesicles did not alter the isothiocyanate composition of the formulations. The vesicles characterization revealed a highly fatty acids unsaturation degree together with the presence of sitosterol, that contribute to a greater permeability to water of the bilayer. On the other side, the presence of aquaporins, such as PIP1 and PIP2 in the vesicles was directly correlated with the high osmotic permeability values analysed. This confers to the vesicles a high adaptation to osmotic changes in the medium. Furthermore, the use of cauliflower vesicles increased the conservation of isothiocyanates during the gastrointestinal digestion, favouring the bioaccesibility and biodisponibility. Finally, differences of metabolization between the formulations were observed in hepatocytes cell cultures (HepG2) and the influence of red cabbage formulations on the gut microbiome of obese volunteers resulted in the increase of butyric acid production, enlightening the benefits of these formulations as coadjuvants in the intervention of noncommunicable diseases.