Función de la proteína CarF en la transducción de la señal luminosa en la bacteria "Myxococcus xanthus" y su conservación en eucariotas superiores

Abstract

La proteína membranal CarF desempeña un papel clave en una de las dos rutas que operan en Myxococcus xanthus para percibir la luz azul y defenderse del estrés fotooxidativo derivado de la fotoexcitación de la protoporfirina IX y la consiguiente formación de oxígeno singlete (1O2). Recientemente, hemos desvelado que CarF es la desaturasa de plasmaniletanolamina (PEDS1) que genera el enlace vinil-éter de los plasmalógenos, y que son estos glicerofosfolípidos especiales los que, de algún modo, señalizan el estrés fotooxidativo. El objetivo global de este trabajo ha sido profundizar en el modo de acción de CarF y sus homólogos de animales, la biosíntesis de los plasmalógenos y sus precursores con enlace éter en M. xanthus, y el novedoso mecanismo molecular de percepción de la luz a través de los plasmalógenos. CarF presenta 12 histidinas citoplásmicas, 8 de las cuales se conservan en todos sus homólogos (de mixobacterias, Leptospiraceae y Alphaproteobacteria, entre las bacterias; de animales y plantas, entre los eucariotas). El análisis realizado reveló que existe una buena correlación entre el grado de conservación de las histidinas y su importancia funcional. Entre las histidinas no conservadas en todos los homólogos, cabe destacar la H113, importante para la función de CarF y presente solo en los homólogos de animales, Myxoccocales y Leptospiraceae. Algunas de las histidinas de CarF podrían participar en la formación de un complejo de di-hierro en el centro activo. Consistente con ello, la preparación de CarF purificada, tras expresión heteróloga y solubilización en Foscolina-12, mostró la presencia de hierro (~2Fe:1CarF). En dicha preparación, que presentó cierta actividad PEDS1, CarF manifestó una tendencia a formar homomultímeros cuya relevancia funcional se desconoce. Para obtener una preparación de CarF más apta para futuros estudios, se probaron diversas estrategias: expresión de versiones truncadas, expresión de CarF en un ambiente con lípidos éter, expresión de proteínas homólogas, y solubilización de CarF en nanodiscos poliméricos. A pesar de la enorme distancia evolutiva entre las mixobacterias y los animales, todos los homólogos de animales probados, incluido el humano, complementaron la falta de CarF en M. xanthus. Por el contrario, no lo hicieron ni los homólogos de plantas ni el de Alphaproteobacteria analizados. Así pues, como CarF, sus homólogos de animales se corresponden con la PEDS1, cuya identidad había sido una incógnita durante casi 50 años. A diferencia de mamíferos, M. xanthus dispone de dos rutas para sintetizar los precursores de los plasmalógenos: una principal, ampliamente distribuida en mixobacterias, en la que interviene la proteína multidominio ElbD (y, posiblemente, otros productos génicos del operón elbA-E); otra, auxiliar y restringida al género Myxococcus, en la que intervienen los tres productos génicos del operón MXAN_1676-1674. Los análisis experimentales y comparativos permiten postular en qué pasos de la biosíntesis de los lípidos éter precursores podrían participar los genes de cada operón en la ruta correspondiente. El trabajo realizado demuestra que el único determinante de los plasmalógenos imprescindible para su papel en M. xanthus es el enlace vinil-éter. La susceptibilidad de dicho enlace a la rotura por 1O2, dando lugar a un aldehído graso y un liso-fosfolípido, podría explicar cómo los plasmalógenos señalizan el estrés fotooxidativo. Sin embargo, mientras que in vitro se detectó una rotura acusada del plasmalógeno por 1O2, in vivo dicha rotura fue sutil. Cabe pensar, por tanto, que M. xanthus haya desarrollado un sistema extremadamente sensible para percibir la mínima cantidad de plasmalógeno roto y desencadenar la respuesta fotoprotectora, evitando los efectos tóxicos que generarían un exceso de productos de degradación del plasmalógeno. Para facilitar el estudio de este complejo mecanismo se han empezado a poner a punto técnicas más sofisticadas como la “química clic”.

The membrane protein CarF plays a key role in one of the two pathways that operate in Myxococcus xanthus to sense blue light and defend the bacterium against photooxidative stress, which stems from the photoexcitation of protoporphyrin IX and consequent generation of singlet oxygen (1O2). We have recently discovered that CarF is the plasmanylethanolamine desaturase (PEDS1) that generates the vinyl-ether bond in plasmalogens, and that this special class of glycerophospholipids somehow signals photooxidative stress. The overall goal of this work has been to delve in-depth into the mode of action of CarF and its homologs in animals, the biosynthesis of plasmalogens and its ether bond precursor in M. xanthus, and the novel molecular mechanism of light perception via plasmalogens. CarF contains twelve cytoplasmic histidines, eight of which are conserved in all homologs (from myxobacteria, Leptospiraceae and Alphaproteobacteria among bacteria; from animals and plants among eukaryotes). Our analysis revealed a good correlation between the extent of conservation of these histidines and their functional importance. Among the histidines that are not conserved in all homologs, H113 deserves a special mention, as it is essential for CarF function and is conserved only in animals, Myxoccocales and Leptospiraceae homologs. Some of the histidines in CarF may participate in the formation of a diiron cluster active site. Consistent with this, the CarF sample, purified after heterologous expression and solubilization in Foscholine-12, was shown to contain iron (~2:1 Fe:CarF). This purified CarF, which exhibits some PEDS1 activity, displayed a tendency to form homooligomers whose functional relevance is unknown. To obtain purified CarF better suited for future studies, diverse strategies were tested: expression of truncated versions, expression of CarF in a cellular environment with ether lipids, expression of protein homologs, and CarF solubilization using polymer nanodiscs. Despite the enormous evolutionary distance between myxobacteria and animals, all animal homologs tested, including the human one, complemented the lack of CarF in M. xanthus. By contrast, none of the plant homologs or that from Alphaproteobacteria analyzed could do so. Thus, as with CarF, its animal homologs correspond to the PEDS1, whose identity had remained unknown over almost 50 years. Unlike mammals, M. xanthus has two pathways available to synthesize the precursors of plasmalogens: a main pathway, widely distributed among myxobacteria, involving the multidomain protein ElbD (and, possibly, other gene products of the elbA-E operon); an ancillary pathway, restricted to the genus Myxococcus, in which the three gene products of the MXAN_1676-1674 operon participate. Experimental and comparative analyses allow us to propose the possible steps wherein the genes of each operon act in the corresponding pathway for the biosynthesis of the ether lipid precursors. The work accomplished demonstrates that the sole determinant in plasmalogens indispensable for their role in M. xanthus is the vinyl ether bond. Susceptibility of this bond to cleavage by 1O2, yielding a fatty aldehyde and a lysophospholipid, could explain how plasmalogens signal photooxidative stress. Nonetheless, whereas such a degradation of plasmalogens by 1O2 was clearly detected in vitro, this cleavage was more subtle in vivo. It may thus be speculated that M. xanthus may have developed a highly sensitive system to sense tiny amounts of lysed plasmalogen to trigger the photoprotective response and evade the toxic effects that may be generated by an excess of plasmalogen degradation products. To address the study of this complex mechanism, we have initiated efforts to deploy more sophisticated techniques such as “click chemistry”.