Shewanella putrefaciens Pdp11 and arginine as feed additives for gilthead seabream (Sparus aurata L.) : effect on skin regeneration and intestinal function in wounded fish

Abstract

El objetivo de la presente Tesis Doctoral es explorar el efecto de la administración dietética de SpPdp11 y ARG sobre la regeneración de la piel y la función intestinal en doradas heridas. Los resultados del análisis de imágenes de las heridas externas macroscópicas mostraron que la administración dietética de SP y ARG1 podría facilitar significativamente el cierre de la herida. Las heridas cutáneas mostraron algunos cambios negativos en los parámetros metabólicos del suero de dorada. Aún así, la administración de SP y ARG1 podría aliviar significativamente estos impactos y mantener la homeostasis. Además, las actividades de las enzimas inmunes en el moco de la piel se vieron reforzadas por la suplementación de SpPdp11 y 1% ARG. A diferencia de los mamíferos, la fase de formación de coágulos de sangre falta en el proceso de curación de heridas de los peces, aunque están presentes las otras etapas, que incluyen inflamación, reepitelización, formación de tejido nuevo y remodelación. Las dietas SP y ARG1 aliviaron la respuesta inflamatoria de la piel, lo que podría atribuirse al efecto beneficioso de SpPdp11 y ARG1 sobre la capacidad antioxidante de la piel. En el proceso de reepitelización, la administración dietética de SpPdp11 y ARG al 1% aceleran la eliminación de tejidos necróticos, liberan factores de crecimiento de la matriz de la herida y ayudan a la migración y proliferación de queratinocitos, y por lo tanto facilitan la reepitelización en la piel de dorada herida. Los impactos de las heridas de la piel en la función intestinal son multifacéticos. La histología intestinal mostró que se observaron infiltraciones más profundas de leucocitos mixtos en la lámina propia en el intestino distal de doradas 7 días después de la herida. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) indicaron que las heridas en la piel aumentaron la expresión del nivel de inmunoglobulina en el intestino. El presente estudio también analizó la expresión génica de citocinas inflamatorias, parámetros relacionados con la inmunidad, mucinas y proteínas de unión estrecha, como puntos cruciales para evaluar el estado de salud de la función de barrera intestinal de la dorada. Las heridas en la piel mejoraron significativamente la respuesta inflamatoria intestinal mediada por la vía de señalización del receptor tipo toll (TLR)/factor de transcripción nuclear-κB (NF-κB) y la secreción de mucinas, pero suprimieron de manera prominente los parámetros intestinales relacionados con la inmunidad y el ensamblaje de las uniones estrechas. Sin embargo, la administración de la dieta SP y ARG1 alivió las profundas infiltraciones de leucocitos mixtos en la lámina propia y la reducción de la función inmune intestinal. Además, la adición dietética de SpPdp11 y ARG al 1% podría reducir notablemente la inflamación intestinal y la sobresecreción de mucinas en la luz intestinal inducida por la herida de la piel. Además, también se elevó la expresión de las proteínas de unión estrecha. En general, la inclusión en la dieta de SpPdp11 y ARG al 1 % facilitó la cicatrización de heridas y la reepitelización de la piel dañada, alivió la respuesta inflamatoria en el área de la herida y mejoró la neovascularización y la síntesis de proteínas de matriz en los sitios de herida de la piel de pescado. Además, las heridas en la piel provocaron una respuesta inflamatoria intestinal que incluyó cambios en la capa de moco y alteraciones en las uniones estrechas. Además, la administración preventiva de SpPdp11 y ARG al 1% alivió las disfunciones intestinales provocadas por heridas cutáneas en doradas.

The present study focuses on two major organs, the skin and intestine, which are in direct contact with, persistently exposed to, the external milieu, providing a tight barrier against pathogenic infections and coexisting with a myriad of commensal organisms. The aim of the present Doctoral Thesis is to explore the effect of dietary administration of Shewanella putrefaciens Pdp11 (SpPdp11) and arginine (ARG) on skin regeneration and intestinal function in experimentally wounded gilthead seabream. The results could make strides in replacing antibiotics and promoting safer aquaculture. The experimental chapters have been divided into two parts. The image analysis results of the macroscopic external wounds showed that dietary administration of SP and ARG1 could significantly facilitate the wound closure. The skin wounds showed some negative changes in the metabolic parameters in the serum of gilthead seabream. Still, the administration of SP and ARG1 could significantly alleviate these impacts and maintain the homeostasis. Besides, the activities of the immune enzymes in the skin mucus were enhanced by the supplementation of SpPdp11 and 1% ARG. Unlike mammals, the blood-clot formation phase is lacking in the wound healing process of fish, although the other stages, including inflammation, re-epithelialization, new tissue formation, and remodeling, are present. The SP and ARG1 diets alleviated the inflammatory response in the skin, which might attribute to the beneficial effect of SpPdp11 and ARG1 on the antioxidant capacity in the skin. In the process of re-epithelialization, dietary administration of SpPdp11 and 1% ARG accelerate the removal of necrotic tissues, releasing growth factors from the wound matrix and helping the migration and proliferation of keratinocytes, and thereby facilitate the re-epithelialization in the skin of wounded gilthead seabream. The impacts of skin wounds on intestinal function are multifaceted. The intestinal histology showed that more profound infiltrations of mixed leucocytes in the lamina propria were observed in the distal intestine of gilthead seabream 7 days post-wounding. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis indicated that skin wounds increased the expression of immunoglobulin level in the intestine. The present study also analyzed the gene expression of inflammatory cytokines, immune-related parameters, mucins, and tight junction proteins, as a crucial points to evaluate the health status of the intestinal barrier function of gilthead seabream. The skin wounds significantly enhanced the intestinal inflammatory response mediated by toll-like receptor (TLR)/nuclear transcription factor-κB (NF-κB) signalling pathway and the secretion of mucins but prominently suppressed the intestinal immune-related parameters and tight junction assembly. However, SP and ARG1 diet administration alleviated the profound infiltrations of mixed leucocytes in the lamina propria and the reduction of the intestinal immune function. Besides, dietary addition of SpPdp11 and 1% ARG could remarkably reduce the intestinal inflammation and over secretion of mucins in the intestinal lumen induced by the skin wound. Moreover, the expression of the tight junction proteins was also elevated. Overall, SpPdp11 and 1% ARG dietary inclusion facilitated the wound healing and the re-epithelialization of the damaged skin, alleviated the inflammatory response in the wound area, and enhanced the neo-vascularization and the synthesis of matrix proteins in the skin wound sites of fish. Furthermore, the skin wounds provoked an intestinal inflammatory response that included changes in the mucus layer and tight junction disruptions. Besides this, the preventive administration of SpPdp11and 1% ARG alleviated the intestinal dysfunctions caused by skin wounds in gilthead seabream.