Mycoplasma bovis infection in Spanish cattle herds and evaluation of new control strategies

Abstract

El objetivo general de esta tesis por compendio es contribuir a una mejor comprensión de la infección por Mycoplasma bovis y de la biología del patógeno, así como al establecimiento de nuevas medidas de control. Los objetivos específicos y la metodología seguida fueron: 1) Evaluar la presencia y circulación de M. bovis en rebaños bovinos españoles, empleando una gran colección de muestras obtenidas de ganado bovino de carne y de leche, y de distintas fuentes; 2) Investigar la circulación de diferentes subtipos mediante secuenciación unilocus del gen polC, estudiando diferencias de susceptibilidad antimicrobiana entre los subtipos y la presencia de mutaciones genéticas que confieren resistencia; 3) Evaluar el papel de M. bovis en la enfermedad respiratoria clínica sin respuesta al tratamiento antimicrobiano en terneros de cebo en España, mediante bacteriología, histopatología e inmunohistoquímica, y determinar los valores de concentración mínima inhibitoria de los aislamientos obtenidos al set de antimicrobianos empleados para el tratamiento in vivo; 4) Investigar si la transferencia cromosómica de los micoplasmas puede ocurrir en el campo, analizando la presencia de genomas en mosaico en aislamientos de M. bovis mediante secuenciación del genoma completo; 5) Evaluar la viabilidad de M. bovis en semen diluido tras la adición de un antimicrobiano (enrofloxacino o doxiciclina), o un probiótico a base de Lactobacillus spp. a diferentes concentraciones en condiciones in vitro; 6) Evaluar la viabilidad de M. bovis en moco cervical tras la adición de un probiótico a base de Lactobacillus spp. a diferentes concentraciones en condiciones in vitro. Los resultados obtenidos permiten concluir que: 1) M. bovis se encuentra ampliamente distribuido en los rebaños españoles de bovino de carne y está implicado en casos de mastitis en los rebaños de leche; 2) Los aislamientos españoles de M. bovis se dividen en dos grupos, el ST2 y el ST3, siendo ambos resistentes a los macrólidos, lincosamidas y tetraciclinas. La mayoría de los aislamientos del ST3 son resistentes a las fluoroquinolonas, situación que ilustra la notable capacidad del ST3 de acumular mutaciones en las regiones determinantes de resistencia a quinolonas y la presión selectiva impuesta por el uso indiscriminado de estos antimicrobianos. La valnemulina ha mostrado ser eficaz frente a ambos subtipos in vitro; 3) M. bovis juega un papel importante en casos clínicos de enfermedad respiratoria en terneros de cebo en España. La bronconeumonía caseonecrótica es el patrón morfológico más frecuentemente observado en los animales infectados con M. bovis y los patrones indicativos de otras especies bacterianas y virus pueden ser detectados simultáneamente; 4) Los aislamientos de M. bovis recuperados de animales con enfermedad respiratoria clínica son resistentes in vitro a la mayoría de los antimicrobianos empleados para el tratamiento in vivo; 5) La coexistencia de linajes de M. bovis a nivel de rebaño e incluso a nivel de animal permite eventos de transferencia genética horizontal como la transferencia cromosómica de los micoplasmas. Estos eventos contribuyen a la amplia diversidad del genoma y podrían tener un impacto negativo en el diagnóstico y control de la enfermedad; 6) En las condiciones analizadas, la adición de Lactobacillus spp., enrofloxacino o doxiciclina afecta negativamente a la viabilidad de M. bovis en semen diluido, lo que podría ser de utilidad para el tratamiento de las dosis seminales y reducir el riesgo de transmisión de M. bovis durante la inseminación artificial. La dilución con el diluyente seminal Tris-citrato-fructosa también afecta negativamente a la viabilidad del agente, aunque en menor medida que la adición del probiótico y antimicrobianos; 7) En las condiciones analizadas, la adición de Lactobacillus spp. afecta negativamente a la viabilidad de M. bovis en moco cervical, lo que podría ser de utilidad para controlar la proliferación de M. bovis el tracto cérvico-vaginal de las vacas.

The overall goal of this thesis is to contribute to a better understanding of Mycoplasma bovis infection and the biology of the pathogen, as well as to the establishment of new control measures.The specific objectives and methods were: 1) To assess the presence and circulation of M. bovis in Spanish cattle herds using a large collection of samples collected from beef and dairy cattle and from different sources; 2) To investigate the circulation of different subtypes by single-locus sequencing of the polC gene, studying differences in antimicrobial susceptibility between subtypes and the presence of genetic mutations conferring resistance; 3) To address the role of M. bovis in clinical respiratory disease unresponsive to antimicrobials in feedlot calves in Spain through bacteriology, histopathology and immunohistochemistry, and to determine the minimum inhibitory concentration values of the isolates recovered against the specific set of antimicrobials used for the therapy in vivo; 4) To investigate whether mycoplasma chromosomal transfer occurs in the field, analyzing the occurrence of mosaic genomes among M. bovis isolates by whole-genome sequencing; 5) To assess the viability of M. bovis in diluted semen after the addition of an antimicrobial (enrofloxacin or doxycycline), or a Lactobacillus spp.- based probiotic at different concentrations under in vitro conditions; 6) To assess the viability of M. bovis in cervical mucus after the addition of a Lactobacillus spp.-based probiotic at different concentrations under in vitro conditions. The obtained results allowed us to conclude that: 1) M. bovis is widely extended in Spanish beef cattle herds and it is also implicated in mastitis cases affecting dairy herds; 2) Spanish M. bovis isolates analyzed are divided into two groups, ST2 and ST3, both being resistant to macrolides, lincosamides and tetracyclines. Most ST3 isolates are resistant to fluoroquinolones, a situation that illustrates the remarkable capacity of ST3 to accumulate mutations in the quinolone resistance-determining regions and the selective pressure imposed by the indiscriminate use of these antimicrobials. Valnemulin has been shown to be effective against both subtypes in vitro; 3) M. bovis plays a significant role in cases of clinical respiratory disease affecting feedlot calves in Spain. Caseonecrotic bronchopneumonia is the morphological pattern most frequently observed in animals infected with M. bovis, and patterns indicative of other bacteria species and viruses can be concurrently detected; 4) M. bovis isolates recovered from animals with clinical respiratory disease are resistant in vitro to most of the antimicrobials specifically used for therapy in vivo; 5) The co-existence of M. bovis lineages at the herd level and even at the animal level enables events of horizontal gene transfer like mycoplasma chromosomal transfer. These events contribute to wide-genome diversity and may have a negative impact on diagnosis and disease control; 6) Under the conditions analyzed, the addition of Lactobacillus spp., enrofloxacin or doxycycline negatively affects M. bovis viability in diluted semen, which could be useful to treat seminal doses and reduce the risk of transmission of M. bovis during artificial insemination. Dilution with the semen extender, Tris-citrate-fructose also negatively affects the viability of the agent, although to a lesser extent than the addition of the probiotic and antimicrobials; 7) Under the conditions analyzed, the addition of Lactobacillus spp. negatively affects M. bovis viability in cervical mucus, which could be useful to control M. bovis proliferation in the cervico-vaginal tract of cows.