Estructura y función de la Ribonucleasa R3B2 implicada en el mecanismo de silenciamiento génico de "Mucor lusitanicus"

Abstract

El silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS) o interferencia por RNA (RNAi) fue uno de los descubrimientos con mayor impacto en el campo de la biología de la década de los 90. Actualmente, múltiples investigaciones continúan en curso con el objetivo de comprender la diversidad de rutas de RNAi que pueden encontrarse en cada uno de los linajes eucarióticos. Estos mecanismos utilizan pequeños RNAs interferentes (siRNAs) para identificar y degradar los transcritos complementarios o inhibir su traducción en proteínas. Desde su descubrimiento inicial en hongos, el mundo de los pequeños RNAs (sRNAs) y los mecanismos de RNAi está en constante expansión. Se ha demostrado su participación en el control de procesos fundamentales para el estilo de vida de estos organismos como el crecimiento, la reproducción, la adaptación al estrés y la patogénesis. En este trabajo hemos llevado a cabo una minuciosa caracterización de la inusual RNasa R3B2 de Mucor lusitanicus con el objetivo de esclarecer la compleja interacción de la principal ruta de RNAi de este hongo, que es un mecanismo canónico donde las RNasas Dicer producen los siRNA, y la ruta no canónica de RNAi (NCRIP), donde R3B2 degrada transcritos endógenos específicos sin la producción de los siRNA clásicos. Hemos determinado que R3B2 es capaz de unir tanto RNA de cadena sencilla (ssRNA) como RNA de doble cadena (dsRNA) in vitro, a pesar de ser solo capaz de degradar el primero. La dimerización de la proteína da lugar a un canal estrechado para la entrada de RNA en relación a otras RNasas III bien descritas que sugiere un impedimento estérico para el acceso del dsRNA a los centros catalíticos. De hecho, la posición relativa de una lisina (K84) respecto al centro catalítico y la naturaleza cargada de la cadena lateral del aminoácido podría explicar la preferencia de uracilo en la penúltima posición de los sRNA generados por la NCRIP. Esto último nos ha permitido proponer un modelo para el procesamiento de ssRNA por R3B2. R3B2 interacciona con las proteínas Dicer de M. lusitanicus estableciendo una conexión directa entre la RNAi canónica y la NCRIP. Los ensayos mostraron que el contacto entre R3B2 y Dicer-1 era más intenso que con Dicer-2, involucrando dos regiones claramente diferentes de estas últimas proteínas. Estas interacciones sugieren un papel inhibidor de R3B2 sobre la actividad Dicer afectando a la unión de dsRNA mediada por PAZ y recordando a la caracterizada en animales entre las proteínas Dicer y sus acompañantes con múltiples dominios de unión al dsRNA. Nuestro análisis mutacional de las regiones de interacción de R3B2 reveló que ambas son necesarias para la RNAi canónica y sugieren una explicación al papel positivo y negativo de la proteína en los procesos mediados por esta ruta. La especificidad de sustrato y estos resultados in vivo sugieren que R3B2 es necesaria para cortar las regiones de ssRNA en el dsRNA generando los extremos adecuados requeridos por Dicer. Exploramos esta posibilidad analizando el efecto de la ausencia de R3B2 sobre la longitud y polaridad de los sRNAs durante el crecimiento activo y la fase estacionaria. Los resultados obtenidos revelaron dos situaciones claramente diferentes en relación al estado de crecimiento y el tipo de genes regulados por los mecanismos de RNAi de M. lusitanicus. Mientras que R3B2 es necesaria para producir los exonic-siRNAs durante el crecimiento exponencial, la proteína era innecesaria o incluso regulaba negativamente la producción de estos siRNA durante la fase estacionaria. Además, R3B2 era innecesaria para el silenciamiento de los Elementos Retrotransponibles Genómicos similares a LINE1 de los Mucoromicetos (Grem-LINE1) durante el crecimiento exponencial, pero los regula negativamente durante la fase estacionaria, como se había descrito previamente.

Post-transcriptional gene silencing (PTGS) or RNA interference (RNAi) was one of the most outstanding discoveries of the 90s decade that impacted biology fields. Nowadays multiple researches are still being conducted to understand the diverse RNAi pathways widespread among every eukaryotic lineage. These mechanisms utilize small interfering RNAs (siRNAs) to target and either degrade the complementary transcripts or block their translation into proteins. Since the initial discovery of the RNAi in fungi, a continuously expanding world of small RNAs (sRNAs) and RNAi mechanisms have demonstrated to participate in the control of fundamental processes of the lifestyle of these organisms such as growth, reproduction, stress adaptation, and pathogenesis. Here in this work, we carry out a detailed characterization of the atypical RNase R3B2 of Mucor lusitanicus in order to shed light over the complex interaction of the main RNAi pathways of this fungus, which are a canonical RNAi mechanism, where the Dicer RNases produce the siRNA, and a non-canonical RNAi pathway (NCRIP), driven by R3B2 that degrades specific endogenous transcripts without the production of typical siRNA. We determined that R3B2 binds in vitro both single-stranded RNA (ssRNA) and double-stranded RNA (dsRNA), although it is only capable to cut ssRNA. The dimerization of the protein results in a narrowed RNA channel regarding other well described RNase III proteins that suggests a restricted access of dsRNA to the catalytic centers of the RNase. In fact, the relative position of a lysine (K84) to the catalytic centers and the charged nature of the lateral chain of the amino acid could explain the preference of U in the penultimate position of the sRNAs generated by the NCRIP, allowing us to propose a mechanistic model for ssRNA processing by R3B2. The in vivo characterization of R3B2 revealed its interaction with Dicer proteins of M. lusitanicus establishing a direct link between the canonical RNAi and the NCRIP. The yeast-two hybrid assay showed that the contact between R3B2 and Dicer-1 was stronger that the detected with Dicer-2, involving two clearly different regions of the proteins. These interactions suggest an inhibitory role of R3B2 over Dicer activity by affecting the PAZ-mediated binding of dsRNA and resembled the characterized in animals between Dicer proteins and their multi-dsRBD domain-containing partners. Our in vivo mutational analysis of the interacting regions of R3B2 revealed that both regions are essential for R3B2 in the canonical RNAi and suggest an explanation to the positive and negative role of R3B2 on the processes mediated by this pathway. The substrate specificity and these in vivo results suggest that R3B2 is necessary to cleave the ssRNA stretches of the dsRNA in order to produce adequate dsRNA termini for Dicer processing. We explored this possibility by analyzing the effect of R3B2 absence over the sRNA length and strand polarity distribution during active growth and the stationary phase. The results obtained revealed two clearly different situations in regard of the growth state and the type of genes regulated by the RNAi mechanisms of M. lusitanicus. While R3B2 is necessary to produce exonic-siRNAs (ex-siRNA) during exponential growth, it was completely dispensable or even a negative regulator of the production of these siRNAs during the stationary phase. In addition, it was dispensable for the silencing of Genomic Retrotransposable Elements of Mucoromycotina LINE1-like (Grem-LINE1) during exponential growth, but negatively regulates them during the stationary phase, as previously described.