Importance of associated weeds and cropping systems in shaping the viromes of horticultural crops

Abstract

La metagenómica basada en la secuenciación de alto rendimiento (HTS) ha abierto una nueva era de descubrimiento no sesgado y caracterización genómica de los virus. Al igual que en el caso de los virus de otros reinos, los estudios metagenómicos indican que la diversidad de los virus de las plantas estaba hasta hace poco muy subestimada. Como componentes potencialmente importantes de los ecosistemas silvestres o cultivados, es necesario explorar la diversidad de los virus asociados a las poblaciones de plantas y comprender los factores que determinan su diversidad en el espacio y el tiempo. Al mismo tiempo, el desarrollo de este tipo de estudios sigue enfrentándose a cuestiones metodológicas importantes, por ejemplo, en relación con la elección del procesamiento de las muestras, o con la reproducibilidad de los análisis. Los enfoques de HTS, junto con los métodos más tradicionales, pueden utilizarse para estudiar las interacciones de los virus con otros organismos hasta la escala del ecosistema. Estas herramientas permiten analizar los viromas en diferentes ecosistemas, descubriendo la diversidad de los virus de las plantas y ayudándonos a entender mejor la epidemiología, ecología y evolución de los virus de las plantas. Así pues, el objetivo general de esta tesis ha sido utilizar HTS para estudiar la importancia de las malas hierbas y los sistemas de cultivo en la conformación de los viromas de los cultivos hortícolas. En una primera fase, como se describe en el primer capítulo de esta tesis, utilizamos dos métodos de preparación del ARN y desarrollamos un procedimiento bioinformático para el análisis de los datos de HTS. A continuación, aplicamos los métodos puestos a punto para la detección de virus en una colección de muestras de tomate con síntomas similares a los causados por virus. Los resultados de la identificación de virus fueron confirmados por métodos convencionales y el procedimiento bioinformático fue la base para los estudios posteriores de esta tesis. Encontramos que la preparación de ARN bicatenario ARNbc proporcionaba una mejor cobertura en comparación con la preparación de RNA total para la mayoría de los virus. Sin embargo, el método de ARNbc generó muchos problemas durante el proceso de secuenciación, no cumpliendo a menudo los requisitos de preparación de genotecas que exigen la necesidad de un paso de preamplificación. Además, la preparación de ARNbc consumía mucho tiempo, por lo que no parece un método adecuado para manejar un gran número de muestras. Utilizando nuestro procedimiento bioinformático, hemos descrito con éxito tres virus que infectan los cultivos de tomate en España y que no habían sido descritos previamente: el virus de la descoloración del fruto del tomate, el virus de la necrosis anular de la lechuga y el virus latente del olivo. En una segunda fase, tal y como se describe en el capítulo 2 de esta tesis, analizamos y comparamos los viromas del melón y de tres malas hierbas comunes encontradas en los bordes de los cultivos. Determinamos la incidencia de los virus que infectan al melón y descubrimos el papel que estas malas hierbas pueden desempeñar en la ecología y evolución de los virus, realizando estudios de genética de poblaciones, filogenética y análisis de migración de los virus comunes al melón y las malas hierbas. Descubrimos que el virus del amarilleamiento transmitido por pulgones de las cucurbitáceas (CABYV) y el virus de Nueva Delhi del rizado de la hoja del tomate (ToLCNDV) infectaban tanto al melón como a Ecballium elaterium. La población de CABYV era diversa y estaba estructurada de acuerdo con el huésped. La población deToLCNDV era mucho menos diversa. El análisis de los flujos potenciales de migración del virus entre los dos hospedadores no mostró evidencia de migración entre los dos hospedadores. En el caso del ToLCNDV, se encontró evidencia de migración del melón a E. elaterium, pero no al revés. En una tercera fase, descrita en el capítulo 3 de esta tesis, se caracterizaron y describieron en detalle los genomas de dos nuevos virus que pueden constituir nuevas especies putativas, encontrados en las malas hierbas circundantes de los cultivos de melón. También se determinó la incidencia de estos dos virus en las malas hierbas. Por último, tal y como se describe en el capítulo 4, se estudió la influencia de dos diferentes agroecosistemas en la estructura y diversidad de los viromas, analizando las viromas de las explotaciones de lechuga realizadas bajo prácticas ecológicas o convencionales. En ambos sistemas se caracterizaron también las viromas de malas hierbas asociadas a este cultivo. Encontramos un solapamiento parcial de los viromas de la lechuga en ambos sistemas de cultivo y las malas hierbas, lo que indica la importancia del sistema de producción para determinar los virus que afectan al cultivo, y no se encontró solapamiento de virus entre la lechuga y las malas hierbas asociadas en cada sistema de cultivo específico.

Metagenomics based on high throughput sequencing (HTS) has opened a new era of unbiased discovery and genomic characterization of viruses. As for other viruses from other kingdoms, metagenomic studies indicate that the diversity of plant viruses was until recently far underestimated. As potentially important components of unmanaged and cultivated ecosystems, there is a need to explore the diversity of the viruses associated with plant populations and to understand the drivers shaping their diversity in space and time. At the same time, the development of such studies is still challenged by methodological questions concerning, for example, the choice of target nucleic acid populations, or the reproducibility of the analyses. HTS approaches coupled with more traditional methods can be used to study interactions up to the ecosystem scale. These tools allow to analyze viromes in different ecosystems, uncovering plant virus diversity and helping us to better understand plant virus epidemiology, ecology, and evolution. Thus, the overall objective of this thesis was to use HTS to study the importance of associated weeds and cropping systems in shaping the viromes of horticultural crops. In a first stage, as described in the first chapter of this thesis, we used two RNA input methods and developed a bioinformatics pipeline for the analysis of HTS data. Then, we applied them for the detection of viruses in a collection of tomato samples showing virus-like symptoms. The results of the virus identification were further confirmed by conventional methods and the pipeline was the basis for the further studies of the thesis. We found that the dsRNA input provided better coverage in comparison to the total RNA input for most viruses. However, the dsRNA method generated many troubles during the sequencing process, failing often to meet the requirements for library preparation calling for the need of a pre-amplification step. In addition, it was time consuming, making it unsuitable for handling large number of samples. Using our pipeline, we successfully reported three viruses previously undescribed infecting tomato crops in Spain: tomato fruit blotch virus, lettuce ring necrosis virus and olive latent virus. In a second stage, as described in the second chapter of this thesis, we analyzed and compared the viromes of melon and three common weeds found in the edges of the crops. We determined the incidence of the viruses infecting melon, and we uncovered the role(s) that these weeds may play in virus ecology and evolution by conducting population genetics, phylogenetic and migration studies on the viruses overlapping between the melon and the weeds. We found that cucurbit aphid borne yellows virus (CABYV) and tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) were infecting both melon and Ecballium elaterium. The CABYV population was diverse and structured by the host. The ToLCNDV population was much less diverse. The analysis of potential virus migration fluxes between the two hosts showed no evidence of migration between CABYV populations of the two hosts. For ToLCNDV, evidence of migration from melon to E. elaterium but not the other way around was found. In a third stage, described in chapter three of this thesis, we characterized and described in detail the genomes of two novel viruses which may constitute new putative species, found in the surrounding weeds of melon crops. The incidence of these two viruses in weeds was also determined. Lastly, as described in chapter four, we studied the influence of different agro-ecosystems on viromes’ structure and diversity by analyzing the viromes in lettuce farms conducted under ecological or conventional practices. The viromes of weeds associated with this crop were also characterized in both systems. We found a limited overlap of the lettuce viromes between both cropping systems, indicating the importance of the croppring system in determining the viruses affecting the crop, and no virus overlap was found between lettuce and its associated weeds.