Composición del fluido oviductal: estudio comparado del fluido oviductal porcino, bovino y de coneja

Abstract

El oviducto es un órgano par que conecta los ovarios con el útero y donde tiene lugar el encuentro de los gametos. El oviducto y el fluido contenido en él son de gran importancia en la fecundación. A lo largo de las fases reproductivas de las hembras varían las características del oviducto y la composición del fluido oviductal. En hembras adultas, la fase periovulatoria es el momento en el que el oviducto está preparado para el encuentro de los gametos y el microambiente es favorable para la fecundación. El estudio de su composición puede resultar útil para mejorar las técnicas de reproducción asistida y condiciones patológicas como la polispermia, que es elevada en la especie porcina cuando la fecundación se realiza in vitro. En este estudio se intenta ampliar el conocimiento sobre la composición del fluido oviductal, realizando un análisis comparativo del fluido oviductal porcino de hembras prepúberes, y adultas en fase periovulatoria y luteal. El estudio se realizó sobre muestras fraccionadas mediante cromatografía líquida y columna de afinidad por heparina, que permitió una mayor identificación de proteínas al realizar el análisis proteómico de las muestras, por técnicas de espectrofotometría de masas, que el análisis proteómico de las muestras sin fraccionar. De las proteínas identificadas se prestó mayor atención a aquellas que eran secretadas, 15, 20 y 23 en prepúber, periovulatorio y luteal. Algunas de las proteínas secretadas, con importancia en la fecundación, fueron descritas por primera vez en el fluido oviductal porcino, como la heparanasa, progranulina o pleiotrofina. Una segunda parte de este trabajo se centró en el estudio del efecto de cada fracción sobre el endurecimiento de la zona pelúcida de los ovocitos, midiendo el tiempo de resistencia a la digestión enzimática tras la incubación de los ovocitos con las fracciones del fluido oviductal estudiadas. El endurecimiento se produjo tras la incubación con el fluido oviductal porcino de hembras en fase periovulatoria. En las fracciones de esta fase es donde mayor número de péptidos de oviductina se detectan, y su cantidad similar entre ellas como también comprobamos mediante técnicas de electroforesis y western blot. Solamente una de las fracciones produjo endurecimiento de la ZP. Fue ña fracción en la que se detectaron una mayor cantidad de proteínas secretadas mediante el análisis proteómico. Por último realizamos un estudio comparado entre fluido oviductal bovino y de coneja en fase periovulatoria, mediante técnicas de electroforesis 2D y DiGE, donde se observó una expresión diferencial en 217 manchas. En las manchas analizadas por MS/MS se identificaron 13 proteínas sobreexpresadas en fluido oviductal bovino frente a FOC y 11 se sobreexpresadas en FOC frente al bovino. Las proteínas sobreexpresadas en FOB muestran distintas acciones relacionadas con la defensa inmunológica, respuestas al estrés oxidativo y procesos relacionados con la interacción con el espermatozoide, mientras que la mayoría de las proteínas sobreexpresadas en el FOC tienen efecto antioxidante y relacionadas con la respuesta inmune.

The oviduct is a paired organ that connects the ovaries to the uterus and where gametes meet. The oviduct and the fluid contained in it are of great importance in fertilization. Throughout the reproductive phases of females, the characteristics of the oviduct and the composition of the oviductal fluid vary. In adult females, the periovulatory phase is the time when the oviduct is ready for gamete encounter and the microenvironment is favorable for fertilization. The study of its composition can be useful to improve assisted reproduction techniques and pathological conditions such as polyspermy, which is high in the porcine species when fertilization is performed in vitro. This study attempts to expand knowledge about the composition of oviductal fluid, performing a comparative analysis of porcine oviductal fluid from prepubertal females, and adult females in the periovulatory and luteal phase. The study was carried out on samples fractionated by liquid chromatography and heparin affinity column, which allowed a greater identification of proteins when performing the proteomic analysis of the samples, by mass spectrophotometry techniques, than the proteomic analysis of the unfractionated samples. Of the identified proteins, greater attention was paid to those that were secreted, 15, 20 and 23 in prepubertal, periovulatory and luteal. Some of the secreted proteins important in fertilization were described for the first time in porcine oviductal fluid, such as heparanase, progranulin or pleiotrophin. A second part of this work focused on the study of the effect of each fraction on the hardening of the zona pellucida of the oocytes, measuring the time of resistance to enzymatic digestion after incubation of the oocytes with the studied FO fractions. Hardening occurred after incubation with the FOP of females in the periovulatory phase. It is in the fractions of this phase that the greatest number of OVGP1 peptides are detected, in similar amounts among them, as we also verified by means of electrophoresis and western blot techniques. Only one of the fractions produces hardening of the ZP, the fraction in which a greater number of secreted proteins has been detected by proteomic analysis. Finally, we carried out a comparative study between bovine and rabbit oviductal fluid in the periovulatory phase, using 2D electrophoresis and DiGE techniques, where a differential expression was observed in 217 spots. In the spots analyzed by MS/MS, 13 proteins overexpressed in bovine oviductal fluid against FOC and 11 overexpressed in FOC against bovine were identified. Proteins overexpressed in FOB show different actions related to immune defense, responses to oxidative stress and processes related to interaction with the sperm, while most of the proteins overexpressed in FOC have an antioxidant effect and are related to the immune response.