Biosynthesis, production and biological activity of singular betalain pigments

Abstract

Tradicionalmente se ha considerado que la unidad estructural que compartían todas las betalaínas era el ácido betalámico, el cual se obtiene tras la ciclación espontánea de 4,5-seco-DOPA, molécula resultante de la acción de la enzima 4,5-DOPA-extradiol-dioxigenasa (DODA) sobre el aminoácido aromático L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). Sin embargo, los trabajos realizados en esta Tesis Doctoral cambian este paradigma, mostrando una nueva unidad estructural y descubriendo fuentes alternativas de pigmentos betalámicos singulares. Los objetivos de esta Tesis fueron: 1- Búsqueda de fuentes alternativas de betalaínas en plantas. 2- Caracterización fisicoquímica de nuevas betalaínas y estudio de sus rutas biosintéticas. 3- Desarrollo de procesos biotecnológicos para la producción de betalaínas, tanto con estrategias microbiológicas como de origen vegetal. 4- Caracterización del potencial promotor de la salud de betalaínas singulares en el modelo animal Caenorhabditis elegans. En la búsqueda de nuevas fuentes de betalaínas, los pigmentos de Dionaea muscipula Ellis, también conocida como Venus atrapamoscas, fueron estudiados. El establecimiento inequívoco de antocianinas en D. muscipula apoya la exclusión de la familia Droseraceae del orden Caryophyllales desde un punto de vista fitoquímico y su inclusión en el orden Nepenthales. Se han establecido las condiciones para el desarrollo de líneas de callos de Chenopodium quinoa en medio sólido que producen diferentes betalaínas. Indicando que el aumento de la hormona 6-benzilaminopurina y la disminución de nitrógeno en el medio de cultivo son factores clave para activar la ruta biosintética de las betalaínas. La detección de dos betaxantinas derivadas de dopamina en granos de quinua abrió la posibilidad de la existencia de múltiples pigmentos derivados de dopamina en la naturaleza. Probablemente ocultos como compuestos menores en los registros de HPLC de plantas. Se ha descrito una nueva ruta biosintética capaz de producir betalaínas descarboxiladas in planta, como se ha demostrado en C. quinoa. La enzima clave en la ruta derivada de dopamina es una 4,5-extradiol-dioxigenasa (DODA) que escinde el anillo de esta amina, y que se ha caracterizado a nivel cinético y molecular. La proteína es una enzima dual y expresa actividad frente a los sustratos de relevancia fisiológica, L-DOPA y dopamina. Con la sola expresión de la enzima DODA, se reprodujo biotecnológicamente el perfil de betalaínas presentes de forma natural en los granos de quinua. Esto se considera una clara demostración de la simplicidad de la ruta biosintética, propuesta con forma cuadrada, necesaria para producir los pigmentos. Se ha descubierto, descrito y caracterizado toda una nueva familia de betalaínas, las 6-descarboxibetalaínas. Todos los miembros caracterizados presentan propiedades de color similares y una fuerte fluorescencia. Sin embargo, las doce betalaínas descarboxiladas estudiadas en esta Tesis presentan diferentes comportamientos in vivo en ensayos de capacidad antioxidante y promotora de la salud en el animal modelo Caenorhabditis elegans. Además, se ha estudiado el potencial de las 6-descarboxibetalínas como moléculas antiagregantes de β-amiloide in vitro. Cuatro betalaínas descarboxiladas han mostrado resultados prometedores con valores IC50 en el rango micromolar, de posible interés en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer. También se ha estudiado como betalaínas carboxiladas tradicionales y extractos naturales reducen el crecimiento tumoral in vivo y amplían la vida media del modelo tumoral de Caenorhabditis elegans (gld-1). La molécula más eficaz en la reducción del tamaño tumoral es la L-triptófano-betaxantina. Las betalaínas actúan no solo como antioxidantes, sino también regulando el factor de transcripción DAF-16. Así, las betalaínas se revelan como potenciales fitoquímicos anticancerígenos, de posible importancia en las estrategias de quimioprevención y tratamiento. Profundizando en esta actividad, se han diseñado nuevas betaxantinas que parten de L-triptófano-betaxantina como molécula líder. Los nuevos pigmentos se han producido biotecnológicamente y se han caracterizado sus propiedades. Todos estos nuevos pigmentos muestran una reducción significativa del tamaño de las gónadas tumorales en C. elegans (gld-1).

Until now it was considered that the structural unit shared by all the betalains was betalamic acid, which is obtained after the spontaneous cyclization of 4,5-seco-DOPA, the resulting molecule after the activity of the enzyme 4,5-DOPA-extradiol-dioxygenase (DODA) on L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA). However, the results obtained in this Thesis shift this paradigm and show alternative sources of singular betalain pigments. The objectives of this Thesis were: 1. Searching for alternative sources of betalains in plants. 2. Physicochemical characterization of novel betalains and the study of their biosynthetic pathways. 3. Development of biotechnological processes for the production of betalains, with both microbiological and plant-based strategies. 4. Characterization of the health-promoting potential of singular betalains in the animal model Caenorhabditis elegans. In the search for novel sources of betalains, the pigments of Dionaea muscipula Ellis, also known as Venus flytrap, were investigated. The unambiguous establishment of anthocyanins in Dionaea muscipula Ellis supports the exclusion of the Droseraceae family from the order Caryophyllales from a phytochemical point of view and its inclusion in the order Nepenthales. The conditions for the development of Chenopodium quinoa callus lines on solid media that produce different betalain pigments have been established. The amount and variety of betalains present in the callus cultures indicate that the increase of the 6-benzylaminopurine hormone and the decrease of nitrogen in the culture medium are key factors to activate the biosynthetic pathway of betalains. The detection of two dopamine-derived betaxanthins in quinoa grains opened up the possibility of the existence of multiple dopamine-derived pigments in nature. In plants, they are probably hidden as minor peaks in HPLC recordings. A novel biosynthetic pathway was described, able to produce decarboxylated betalains in planta, as it has been demonstrated in C. quinoa. The key enzyme in the dopamine-derived pathway is a ring-cleaving 4,5-extradiol-dioxygenase that has been characterized at molecular and kinetic levels. The protein is a dual enzyme and expresses activity against the physiologically relevant substrates L-DOPA and dopamine. With the sole expression of the dual DODA enzyme, the profile of betalains naturally occurring in quinoa grains was reproduced biotechnologically. This is considered a neat demonstration of the simplicity of the square-shaped biosynthetic pathway needed to produce the pigments. An entire novel family of betalains - the 6-decarboxy-betalains - has been discovered, described and characterized. All members assayed present similar color properties and strong fluorescence. The twelve individual decarboxylated betalains studied in this Thesis present different behaviors in in vivo assays for lifespan and antioxidant capacity. The potential of 6-decarboxy-betalains as β-amyloid anti-aggregating molecules has also been studied. Four decarboxylated betalains have shown promising results with IC50 values in the micromolar range, of possible interest in the treatment or prevention of Alzheimer’s disease. Traditional carboxylated betalains and natural extracts reduce tumor growth in vivo and expand the lifespan of the Caenorhabditis elegans tumoral model (gld-1). The most effective molecule in the reduction of tumor size is L-tryptophan-betaxanthin. Betalains act not only as antioxidants, but also by regulating DAF-16 transcription factor. Betalains are revealed as potential anticancer phytochemicals, of possible importance in chemoprevention and treatment strategies. Novel betaxanthins have been designed from L-tryptophan-betaxanthin as a lead molecule. The novel pigments have been biotechnologically produced and purified, and their properties characterized. All the novel pigments show a significant reduction of the size of tumoral gonads in the tumoral animal model C. elegans (gld-1).