Análisis del aire exhalado "off-line" para la búsqueda de biomarcadores de enfermedades respiratorias en la clínica pediátrica

Abstract

En el aire exhalado humano es posible distinguir una gran variedad de compuestos orgánicos volátiles (VOCs). Sin embargo, el conjunto de VOCs, “volatiloma”, presentes en el aire exhalado y su concentración en cada individuo pueden depender de diversos factores, como diferencias en el metabolismo, presencia de patologías o exposición a contaminantes ambientales, entre otros. Por todo ello, en los últimos años, el aire exhalado humano ha sido considerado una fuente prometedora de biomarcadores para el diagnóstico y la monitorización de numerosas patologías como enfermedades respiratorias de alta prevalencia. Asimismo, también se ha sugerido que el análisis del aire exhalado podría ser útil para controlar las exposiciones a contaminantes ambientales y para el seguimiento del estrés oxidativo. Una de las principales ventajas de este enfoque, es que se trata de una metodología no invasiva. La estrategia más extendida para la determinación de VOCs en el aliento humano es el análisis del aire exhalado fuera de línea u off-line mediante tecnologías basadas en espectrometría de masas. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral ha sido aplicar y avanzar en el desarrollo del análisis del aire exhalado off-line para la búsqueda de biomarcadores de enfermedades respiratorias y/o atópicas en población pediátrica y en mujeres en edad fértil. Gran parte de la presente Tesis Doctoral se enmarca dentro del estudio NELA (Nutrition in Early Life and Asthma) que ha reclutado una cohorte de 738 parejas madre/hijo de la Región de Murcia desde la semana 20 de embarazo, con la finalidad de esclarecer el origen del asma durante la infancia y determinar qué factores influyen en su desarrollo. Así, en esta tesis se ha recogido y analizado las muestras de aire exhalado de las parejas de madres e hijos de la cohorte NELA a los 3 meses de edad del niño. En el Capítulo 3, se ha realizado una revisión sistemática de los estudios previos donde se ha aplicado el análisis del aire exhalado en población pediátrica. En el Capítulo 4, se expone el desarrollo de un flujo de trabajo de código abierto para el preprocesamiento de datos brutos obtenidos mediante espectrometría de masas. Además, en este capítulo se muestra un protocolo de recogida de aire exhalado para adultos y niños de corta edad, y un protocolo de análisis del aire exhalado off-line mediante TD-GC/q-MS (desorción térmica acoplada a cromatografía de gases-espectrometría de masas de cuadrupolo simple). En el Capítulo 5, se han identificado perfiles de VOCs en el aire exhalado de mujeres en edad fértil que permiten discriminar entre asmáticas con otras enfermedades atópicas coexistentes y no asmáticas. Asimismo, también se evaluó el impacto de la época del año cuando se realizaron las determinaciones de VOCs, sobre el proceso de descubrimiento de biomarcadores de enfermedades mediante el análisis del aire exhalado off-line, y se desarrollaron estrategias para afrontar los posibles sesgos introducidos. En el Capítulo 6, se estudió la relación entre los VOCs exhalados y la función pulmonar en lactantes sanos. En el Capítulo 7, se determinó la influencia de la exposición a la humedad en los hogares sobre los VOCs en el aire exhalado. Por último, en el Capítulo 8, se evaluó el efecto del almacenamiento de muestras de aire exhalado antes de su análisis mediante sistemas analíticos on-line, concretamente SESI-HRMS (ionización secundaria por electrospray-espectrometría de masas de alta resolución). En base a los resultados obtenidos, las principales conclusiones que se pueden extraer de la presente Tesis Doctoral son: 1) La introducción de las prácticas típicas del campo de la metabolómica es fundamental para alcanzar la traslación clínica del análisis del aire exhalado; 2) Se ha diseñado un protocolo para la recogida y análisis de muestras de aire exhalado mediante TD-GC/q-MS adecuado para población adulta y pediátrica; 3) Se ha desarrollado un flujo de trabajo de código abierto para el preprocesamiento de datos obtenidos en el análisis del aire exhalado off-line mediante TD-GC/q-MS; 4) El análisis del aire exhalado off-line mediante TD-GC/q-MS en mujeres en edad fértil permite diferenciar entre asmáticas con otras enfermedades atópicas coexistentes y no asmáticas (con o sin enfermedades atópicas); 5) Se ha caracterizado la varianza causada por los factores experimentales por implementación de ASCA, que combina el análisis de varianza (ANOVA) y el análisis de componentes simultáneos y se ha solventado el sesgo causado por la estación del año en la que se recolectaban las muestras de aliento; 6) Existe una asociación entre los VOCs exhalados y la función pulmonar en lactantes sanos; 7) La exposición prolongada a humedad en el hogar puede influir en el volatiloma exhalado, concretamente en los niveles del contaminante 2-etil-1-hexanol en mujeres en edad fértil y 8) Las muestras de aire exhalado pueden ser almacenadas durante horas en bolsas de muestreo de gas sin una pérdida determinante de intensidad de los compuestos, y posteriormente ser analizadas mediante SESI-HRMS.

A wide range of volatile organic compounds (VOCs) can be distinguished in human exhaled breath. However, the whole set of VOCs, "volatilome", detected in exhaled breath and their concentration in each subject depends on several factors, such as differences in metabolism, presence of pathologies or exposure to environmental pollutants, among others. For all these reasons, in recent years, human exhaled breath has been considered as a promising source of biomarkers for the diagnosis and monitoring of numerous disorders such as prevalent respiratory diseases. Furthermore, it has also been suggested that breath analysis could be useful for environmental exposure and oxidative stress monitoring. One of the main advantages of this approach is that it is a noninvasive methodology. The most widespread strategy for VOC detection in exhaled breath is off-line breath analysis by mass spectrometry-based technologies. The main objective of this thesis has been to apply and advance in the development of off-line breath analysis for searching for biomarkers of respiratory and/or atopic diseases in the pediatric population and in women of childbearing age. The present thesis is in the context of the NELA study (Nutrition in Early Life and Asthma) which has recruited a large part of a cohort of 738 mother/child pairs in the Region of Murcia from the 20th week of pregnancy, in order to unravel the asthma origin during childhood and to determine which factors influence in its development. So, in this thesis, exhaled breath samples from mother-infant pairs of the NELA cohort were collected and analyzed when children were three months old. In Chapter 3, a systematic review of previous studies where breath analysis has been applied in pediatric population has been carried out. In Chapter 4, the development of an open-source workflow for the preprocessing of raw data obtained by mass spectrometry is shown. In addition, a protocol for exhaled breath collection for adults and young children, and a protocol for off-line breath analysis by TD-GC/q-MS (thermal desorption coupled to gas chromatography-single quadrupole mass spectrometry) are shown in this chapter. In Chapter 5, VOC profiles have been identified in exhaled breath from women of childbearing age that discriminate between asthmatics with other coexisting atopic diseases and non-asthmatics. Furthermore, the impact of the season of the year when VOC determinations are performed on the process of disease biomarker discovery by means of off-line breath analysis was also evaluated, and strategies were implemented to deal with the possible biases introduced. In Chapter 6, the relationship between exhaled VOCs and lung function in healthy infants was studied. In Chapter 7, the influence of exposure to home indoor dampness on VOCs in exhaled breath was determined. Finally, in Chapter 8, the effect of exhaled breath storage prior to analysis using on-line analytical systems, specifically SESI-HRMS (secondary electrospray ionization-high resolution mass spectrometry). Based on the findings of this thesis, the main conclusions are: 1) The introduction of typical practices from the field of metabolomics is fundamental to achieve the clinical translation of breath analysis; 2) A protocol for the collection and analysis of exhaled breath samples by TD-GC/q-MS suitable for adult and pediatric population was designed; 3) An open-source workflow has been developed for the preprocessing of data obtained in off-line breath analysis by TD-GC/q-MS; 4) Off-line breath analysis by TD-GC/q-MS in women of childbearing age allows differentiation between asthmatics with other coexisting atopic diseases and non-asthmatics (with or without atopic diseases); 5) Variance caused by experimental factors has been characterized by implementation of ASCA, which combines analysis of variance (ANOVA) and simultaneous components analysis and solved the bias caused by the season of the year when breath samples were collected; 6) There is an association between exhaled VOCs and lung function in healthy infants; 7) Prolonged exposure to indoor dampness can influence the exhaled volatilome, specifically levels of the pollutant 2-ethyl-1-hexanol in women of childbearing age; and 8) Exhaled breath samples can be stored for hours in gas sampling bags without a substantial loss of compound intensity, and subsequently analyzed by SESI-HRMS.