Estudio de biomarcadores moleculares implicados en el desarrollo de resistencia a tratamiento en cáncer de mama

Abstract

El cáncer de mama es el cáncer diagnosticado con más frecuencia y la primera causa de fallecimiento en mujeres por cáncer a nivel mundial. Uno de los dilemas clínicos más relevantes en el manejo de esta patología es el desarrollo de resistencias terapéuticas. En particular, el CM luminal se caracteriza por la expresión de receptores hormonales y la dependencia de la vía del receptor de estrógenos, por lo que su tratamiento está basado fundamentalmente en terapia hormonal. Este subtipo, a pesar de ser considerado el grupo con mejor pronóstico y más opciones de tratamiento, también se asocia con una tasa de recaída importante que se relaciona con el desarrollo de resistencia hormonal. Se necesitan nuevos biomarcadores pronósticos y predictivos que permitan detectar la enfermedad resistente y estratificar mejor a las pacientes, de forma que sea posible aplicar tratamientos más ajustados a cada perfil de paciente, consiguiendo así, una mayor eficacia y una menor toxicidad. En los últimos años, el estudio de los miRNA tisulares o circulantes y la secuenciación de DNA tumoral a partir de biopsia líquida se han planteado como potenciales biomarcadores en el escenario clínico de la enfermedad resistente al tratamiento. Objetivos: Como objetivo general este trabajo de tesis doctoral se planteó la identificación de biomarcadores tisulares o circulantes (DNA y miRNA) implicados en el desarrollo de resistencia al tratamiento en diferentes escenarios del cáncer de mama, especialmente en el CM luminal. Los objetivos específicos fueron: Objetivo 1-Estudiar el papel de miR-18a-5p en proliferación y respuesta a fármacos en el entorno luminal. Objetivo 2-Estudiar la concordancia de alteraciones moleculares en muestras procedentes de biopsia líquida y biopsia tumoral en pacientes con cáncer de mama metastásico en diferentes situaciones de resistencia a terapia hormonal. Objetivo 3- Analizar los niveles de expresión de miR-200c-3p en muestras de plasma y tejido (antes y después del tratamiento) en mujeres con cáncer de mama localmente avanzado y cáncer de mama metastásico, para así evaluar el papel pronóstico y predictivo de este miRNA en la progresión del CM. Materiales y métodos. Para alcanzar los objetivos se utilizaron muestras de plasma y/o tejido tumoral de controles y pacientes con cáncer de mama con enfermedad localmente avanzada o metastásica, de las que también se recogieron los datos clínicos y de supervivencia. El estudio clínico y biológico fue observacional, sin intervención y retrospectivo. Para el estudio experimental, se utilizaron modelos celulares de cáncer de mama sensible a hormonas y resistente a terapia endocrina. Se emplearon técnicas bioquímicas (western blot, ensayos colorimétricos), técnicas de biología molecular (extracción de ácidos nucleicos, RT-qPCR, PCR digital, NGS) y técnicas de biología celular (inmunoenriquecimiento magnético, citometría de flujo). Los datos obtenidos se analizaron empleando en cada caso las pruebas estadísticas más adecuadas. Resultados. 1. MiR-18a-5p ha mostrado tener un efecto sobre la proliferación y la respuesta a terapia endocrina e inhibidores de CDK4/6 tanto en un entorno sensible a hormonas como resistente a terapia de base hormonal en estudios in vitro. Este miRNA se asoció con resistencia a fulvestrant y sensibilidad a CDK4/6 en entorno hormonosensible y potenció la resistencia intrínseca a fulvestrant e inhibidores de CDK4/6 del modelo resistente a terapia endocrina. Estos datos abren las puertas a estudios preclínicos que profundicen en el estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a estos efectos y estudios clínicos que validen su potencial como biomarcador predictivo en esta neoplasia. 2. Los niveles de ctDNA y la presencia de CTCs se asociaron con progresión de la enfermedad en el CMM luminal. El número de alteraciones detectadas en muestras de biopsia líquida se asoció a progresión y resistencia endocrina. El estudio de concordancia molecular entre las diferentes muestras de biopsia líquida y tumoral, reveló una baja concordancia entre ellas y destacó que la secuenciación de ctDNA podría ser el mejor enfoque para alcanzar una mayor tasa de detección de alteraciones informativas y permitir un estudio secuencial no invasivo. 3. Las pacientes con cáncer de mama localmente avanzado o metastásico presentaron niveles significativamente mayores de miR-200c-3p plasmático con respecto a los controles. La expresión tumoral de miR-200c-3p (antes o después del tratamiento) mostró tener un valor pronóstico desfavorable para la supervivencia global en pacientes con cáncer de mama localmente avanzado tratadas con quimioterapia neoadyuvante y además, se relacionó con proliferación y procesos de transición epitelio-mesénquima. Los niveles tumorales pretratamiento de miR-200c no fueron predictivos de respuesta a quimioterapia adyuvante en estas pacientes. En la serie de cáncer de mama metastásico, los niveles tumorales o plasmáticos de esta miRNA no demostraron valor pronóstico ni predictivo en nuestra serie clínica. Conclusiones. Nuestros resultados apoyan el uso de biomarcadores basados en miRNA, como miR-200, o ctDNA como medio para la estratificación pronóstica y predictiva del cáncer de mama, especialmente en entornos de resistencia endocrina. La investigación en los mecanismos de esa resistencia, como la expuesta para miR-18a, es también necesaria como paso previo para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento.

Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of cancer death in women worldwide. One of the most relevant clinical challenges in the management of this pathology is the development of therapeutic resistance. Particularly, luminal BC is characterized by the expression of hormone receptors and by its dependence on the estrogen receptor pathway, with treatment mainly based on endocrine therapy. This subtype, despite being considered the group with the best prognosis and treatment options, is also associated with a significant relapse rate which is related to endocrine resistance. To apply a less toxic and more efficacious personalized treatment to each patient, new prognostic and predictive biomarkers are needed to detect resistant disease and better stratify patients. In recent years, the study of tissue or circulating miRNAs and tumor DNA sequencing from liquid biopsy have been proposed as potential biomarkers of treatment-resistant disease in the clinical setting. Objectives: As a general objective, this thesis proposed the identification of tissue or circulating biomarkers (DNA and miRNA) involved in the development of treatment resistance in different stages of breast cancer, and especially of luminal BC. The specific objectives were: Objective 1-To study the role of miR-18a-5p in proliferation and response to drugs in the luminal environment. Objective 2-To study the concordance of molecular alterations in samples from liquid biopsy and tumor biopsy in patients with metastatic breast cancer in different settings of resistance to hormone therapy. Objective 3- To analyze the expression levels of miR-200c-3p in plasma and tissue samples (before and after treatment) in women with locally advanced breast cancer and/or metastatic breast cancer, so that we can evaluate the prognostic and predictive role of this miRNA in BC. Materials and methods. To achieve these objectives, we used plasma and/or tumor tissue samples from controls and patients with breast cancer with locally advanced or metastatic disease, from which clinical and survival data were also collected. An observational retrospective design was used for the clinical and translational study. For the experimental study, cell lines of breast cancer with different levels of resistance to endocrine therapy were used. We also employed biochemical techniques (western blot, colorimetric assays), molecular biology techniques (nucleic acid extraction, RT-qPCR, digital PCR, NGS) and cell biology techniques (immunomagnetic enrichment, flow cytometry). The results obtained were analyzed using the adequate statistical tests in each case.

Results. 1. In in vitro studies, miR-18a-5p had an effect on proliferation and on response to endocrine therapy and CDK4/6 inhibitors. In endocrine responsive models this miRNA was associated with fulvestrant resistance and with CDK4/6 inhibitors sensitivity. However, in the endocrine resistance model, miR-18a increased intrinsic resistance to fulvestrant and CDK4/6 inhibitors. These data warrant additional preclinical studies to dilucidate the mechanisms underlying these effects as well as clinical studies to validate its potential as a predictive biomarker in luminal breast cancer. 2. In metastatic breast cancer, higher ctDNA levels and CTCs detection were associated with disease progression. Similarly, a larger number of alterations detected in liquid biopsies (ctDNA or CTCs) was associated with progression and endocrine resistance. The concordance between the different liquid biopsy and tumor samples revealed a low concordance between them. According to our data, ctDNA sequencing, besides allowing a non-invasive sequential study, could be the best approach to achieve a higher detection rate of informative genomic alterations. 3. Patients with locally advanced or metastatic breast cancer showed higher plasmatic levels of miR-200c-3p compared to healthy controls. Higher tumor expression of miR-200c-3p (before and after treatment) in locally advanced breast cancer treated with neoadyuvant chemotherapy conferred a worse prognosis for OS. miR-200c-3p expression in the primary tumor was also related to proliferation and to epithelial mesenchymal transition processes. However, tumor pretreatment levels of miR-200c were not predictive of response to adjuvant chemotherapy in these patients, when evaluated with the rate of pathological complete response. In metastatic breast cancer, tumor or plasma levels of miR-200c-3p did not show prognostic or predictive values in our clinical series. Conclusions. Our results support the use of miRNA-based biomarkers, such as miR-200, or ctDNA as a means for prognostic and predictive stratification of breast cancer, especially in the setting of endocrine resistance disease. Further research into the mechanisms of miRNA-mediated endocrine resistance, such as the data here shown for miR-18a, is also a necessary step for the development of new treatment strategies.