Interacción de un diramnolípido biotensioactivo con membranas fosfolipídicas modelo y membranas biológicas

Abstract

Los ramnolípidos son glicolípidos producidos por la bacteria Gram negativa Pseudomonas aeruginosa formados por la unión de uno o dos anillos de ramnosa a una región hidrofóbica con una o dos cadenas de ácidos grasos, denominándose monoramnolípidos o diramnolípidos (diRL), respectivamente. Estas moléculas son biotensioactivos, compuestos de origen microbiano con estructura anfipática responsable de su actividad superficial sobre las interfases. Los tensioactivos se distinguen por su capacidad de formar diferentes agregados estructurales cuando su concentración en un medio acuoso es elevada, permitiéndoles solubilizar compuestos insolubles. Otras propiedades como su acción emulsionante, estabilizante o antioxidante les otorgan una gran relevancia en diferentes aplicaciones biotecnológicas. Los ramnolípidos son unos de los glicolípidos más estudiados, destacando por presentar actividades biológicas muy interesantes, como su capacidad para inhibir el crecimiento de Bacillus subtilis, eliminar las esporas de varias especies de tres géneros de patógenos de plantas o su capacidad para la inhibir del crecimiento del hongo dimórfico Mucor circinelloides. Con el objetivo de caracterizar los procesos fisicoquímicos responsables de estas actividades diversos estudios han abordado el estudio de la interacción entre ramnolípidos y diferentes membranas biológicas y membranas modelo, proteínas, el remodelado lipídico de la membrana, la permeabilización de membranas, o la formación de liposomas dependientes de pH, entre otros. Por otro lado, varios trabajos han estudiado previamente el comportamiento agregacional de los ramnolípidos en agua, describiendo numerosas estructuras entre las que se incluyen micelas, y varios tipos de vesículas o membranas empaquetadas, indicando que los ramnolípidos pueden formar agregados lamelares, vesiculares o micelares en una forma pH-dependiente. Dada la experiencia de nuestro grupo de investigación en la caracterización de la interacción de ramnolípidos con fosfolípidos de membrana y proteínas, así como en el estudio del comportamiento agregacional de los ramnolípidos en medio acuoso, nos planteamos realizar un trabajo enfocado a ampliar el conocimiento en estas líneas de investigación. En el primer trabajo, se ha caracterizado el comportamiento de fases de mezclas de una especie sintética de fosfatidilserina, 1,2-dimiristil fosfatidilserina (DMPS) con un diramnolípido biotensioactivo producido por P. aeruginosa. Se ha observado que concentraciones crecientes de diRL provocan un incremento progresivo en la temperatura de la transición de fase de gel a líquido-cristalino, así como la separación de fases a concentraciones elevadas del biotensioactivo. Por otra parte, el estudio de los principales grupos funcionales ha revelado un aumento tanto en el desorden de las cadenas acílicas como en la hidratación de las cabezas polares del fosfolípido. Esta sobrehidratación observada en ambas fases, gel y líquido-cristalina, es consecuencia de un cambio conformacional que causa un aumento de la exposición de estas regiones a la capa de agua intermembrana. Posteriormente, se abordó el estudio de la interacción entre diRL y la proteína transmembrana Ca2+-ATPasa de retículo sarco/endoplásmico (SERCA1a), una proteína transportadora de iones presente en las membranas de los almacenes celulares de calcio. A raíz de este trabajo hemos demostrado que la interacción con diRL provoca cambios conformacionales que inestabilizan a la enzima facilitando su desnaturalización térmica, inhibiendo también su actividad ATPasa a concentraciones por debajo del límite de solubilización de membrana. La interacción diRL-SERCA no está relacionada con su actividad superficial sino con las propiedades fisicoquímicas de esta molécula. Finalmente, se estudió el efecto de distintas condiciones de pH y temperatura sobre la estabilidad de los diferentes agregados estructurales supramoleculares del diRL. Entre los resultados de este trabajo cabe resaltar que el diRL adopta estructuras multilamelares organizadas a pH y temperaturas bajas que se ven alteradas al aumentar cualquiera de estos parámetros. Así mismo se describe una transición termotrópica endotérmica en torno a 34ºC de los agregados de diRL protonado. En su conjunto, esta tesis doctoral aporta nueva información sobre las propiedades fisicoquímicas del diRL en medio acuoso y su interacción con membranas fosfolipídicas modelo. Cada publicación, individualmente, es una contribución relevante para desvelar el complejo mecanismo por el que este biotensioactivo interacciona con las membranas biológicas a través de sus diferentes componentes estructurales.

Rhamnolipids are glycolipids produced by the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa formed through the linkage of one or two rhamnose rings to a hydrophobic region composed by one or two fatty acids, being called monorhamnolipids and dirhamnolipids (diRL) respectively. These molecules are biosurfactants, compounds produced by microorganisms with an amphipathic structure responsible for its surface activity over the interfaces. Surfactants are distinguished by their capacity to form structural aggregates when its concentration in an aqueous medium is high, which enables them to solubilize insoluble compounds. Other properties, such as their emulsifying, stabilizing or antioxidative actions, grants them a great relevance on biotechnological applications. Rhamnolipids are some of the most studied glycolipids, being highlighted by its very interesting biological activities, namely, their capacity to inhibit the growth of Bacillus subtilis, eliminate spores of several species among three genera of plant pathogens, or by their capability to inhibit the growth of the dimorphic fungus Mucor circinelloides. To characterize the physicochemical processes responsible for these activities many researchers have focused on the study of the interaction between rhamnolipids and different biological and model membranes, proteins, lipid membrane remodeling, permeabilization of membranes or the formation of pH dependent liposomes, among others. On the other hand, several works have previously studied the aggregation behavior of rhamnolipids in water, describing numerous structures which include micelles, and several types of vesicles or stacked membranes, indicating that rhamnolipids can form lamellar, vesicular, or micellar aggregates in a pH-dependent fashion. On the basis of the previous experience of our research group on the characterization of the interaction between rhamnolipids and membrane phospholipids and proteins, as well as on the study of the aggregation behavior of rhamnolipids in aqueous medium, it was considered to carry out a work focused on expanding knowledge within these lines of research. In the first study, the phase behavior of mixtures of a synthetic species of phosphatidylserine, 1,2-dimyristoylphosphatidylserine, with a diRL fraction produced by P. aeruginosa, was characterized. We have observed that increasing concentrations of diRL caused a progressive rise in the temperature of the gel to liquid-crystalline phase transition, as well as phase separation at high concentrations of biosurfactant. On the other hand, the study of the main functional groups unveiled an increase of both acyl chain disorder and the hydration of the polar head groups of the phospholipid. This increased hydration observed in both gel and liquid-crystalline phases, is due to a conformational change that leads to an augmented exposition of these regions to the water layer. Secondly, the interaction between diRL and the transmembrane model protein sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA1a), an ion transport protein present in the membranes of intracellular calcium storages, was studied. As a result of this work, we demonstrated that the interaction with diRL causes conformational changes that make the enzyme unstable, facilitating its thermal denaturation, and inhibiting its ATPase activity at concentrations below the membrane solubilization threshold. Finally, the effect of various pH and temperature values on the stability of the different aggregation structures of the diRL was studied. Among the many results, it should be noted that diRL adopts fairly organized multilayered structures at low pH and temperature, which become highly disordered upon increasing any of these parameters. In addition, an endothermic thermotropic transition around 34ºC for the diRL aggregates formed by the protonated diRL is described. As a whole, this thesis provides new information on the physicochemical properties of the diRL in water, and its interactions with phospholipid model membranes. Each publication, taken individually, provides individual and necessary contributions to unveil the complex mechanism by which this biosurfactant affects biological membranes through its interaction with their different components.