Implications of mixed infections of two strains of a plant virus on its epidemiology, evolution and interaction with the host

Abstract

El virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) es un potexvirus de ARN monocatenario de polaridad positiva que afecta a cultivos de tomate en todo el mundo. En esta tesis he estudiado las interacciones virus-virus y virus-huésped en infecciones mixtas de aislados de PepMV de dos cepas distintas. Estas interacciones virus-virus y virus-huésped pueden variar dependiendo del aislado del virus, el tipo de infección y la ecología del huésped. En primer lugar, en cuanto a la estructura poblacional de PepMV en el sureste español, se observó que los aislados de PepMV-CH2 eran predominantes, mientras que los aislados de PepMV-EU persistían principalmente en infecciones mixtas. Además, este patrón epidemiológico difirió entre dos zonas geográficamente cercanas, observando una mayor variabilidad genética en la población de PepMV-CH2 donde las infecciones mixtas estuvieron co-circulando. Hasta el momento, se había descrito una interacción antagonista in planta entre un aislado de la cepa Chilena (CH2) y un aislado de la cepa Europea (EU), en la cual se reprimía la acumulación de PepMV-CH2 durante la infección mixta. Se comprobó que esta interacción antagonista ocurría con distintos aislados CH2, independientemente de su procedencia. Posteriormente, se estudió el efecto que un factor abiótico, como la temperatura, podría tener sobre la interacción entre PepMV-EU y PepMV-CH2. Por un lado, se observó que variaciones en la temperatura podían afectar la acumulación viral, siendo la infección por PepMV más productiva a la temperatura más baja (20ºC versus 30ºC). A su vez, el tiempo también tuvo un papel en la interacción entre PepMV-EU y PepMV-CH2, ya que a largos tiempos post-inoculación se dejó de observar la interacción antagonista entre ambos aislados. En cuanto a la carga mutacional, el número medio de variantes en las poblaciones virales se incrementó significativamente con la temperatura, siendo a su vez dependiente de aislado. En este trabajo también se ha estudiado el papel de las sobre-infecciones en el antagonismo asimétrico mostrado por PepMV-EU y PepMV-CH2. PepMV-EU tuvo un efecto protector frente a la infección de PepMV-CH2, sin embargo, la acumulación de PepMV-EU se incrementó en plantas pre-inoculadas con PepMV-CH2. En cuanto al efecto del tipo de infección (simple o mixta) sobre la transmisión viral, se observó una fuerte correlación positiva entre acumulación viral y transmisión, independientemente del tipo de infección que presentaba la fuente de inóculo. También se analizó la diversidad genética de PepMV-EU y PepMV-CH2 en infecciones simples y mixtas en un experimento de pases seriados. Para PepMV-EU, no se encontraron diferencias significativas en el número de sustituciones nucleotídicas entre infecciones simples y mixtas. Sin embargo, se encontró un mayor número de sustituciones en infecciones simples de PepMV-CH2 en comparación con infecciones mixtas. Comparando PepMV-EU y PepMV-CH2, se encontró una mayor diversidad nucleotídica para la población de PepMV-CH2. Por último, en un intento por comprender los mecanismos subyacentes a la interacción virus-virus entre PepMV-EU y PepMV-CH2, se llevó a cabo un análisis transcriptómico de plantas de tomate infectadas con PepMV-EU, PepMV-CH2 o ambos. En primer lugar, se compararon los transcriptomas de plantas con infecciones simples, mostrando que cada cepa viral modulaba diferencialmente el transcriptoma del huésped, así como que las alteraciones transcriptómicas más pronunciadas se producían a tiempos tempranos post-infección. También se demostró que las infecciones mixtas difirieron de las infecciones simples en la respuesta transcriptómica del huésped a tiempos tardíos post-inoculación. Se realizó una búsqueda de genes del huésped que pudieran estar potencialmente implicados en el antagonismo entre PepMV-EU y PepMV-CH2. Se determinó que los genes AGO1a, DCL2d, AGO2a y DCL2b, los cuales están implicados en la ruta de silenciamiento antiviral, fueron regulados al alza durante la infección por PepMV-EU, pero no por PepMV-CH2, a tiempos tempranos post-infección. El patrón de expresión de AGO2a se validó en plantas de tomate y de Nicotiana benthamiana; sin embargo, aunque las plantas mutantes ago2 de N. benthamiana fueron híper-susceptibles a PepMV, no mostraron un cambio en el patrón de antagonismo asimétrico entre PepMV-EU y PepMV-CH2.

Pepino mosaic virus (PepMV) is a single stranded (ss) positive sense (+) RNA potexvirus that affects tomato crops worldwide. In this thesis, I have studied virus-virus and virus-host interactions in mixed strain PepMV infections. These interactions can vary depending on virus isolate, type of infection and host ecology. So far, an in planta antagonistic interaction has been described between an isolate of the Chilean (CH2) strain and an isolate of the European (EU) strain, in which PepMV-CH2 accumulation was repressed during mixed infections. This antagonistic interaction was found to occur with different CH2 isolates, regardless of their origin. Subsequently, the effect that an abiotic factor, such as temperature, could have on the interaction between PepMV-EU and PepMV-CH2 was studied. Temperature had an effect on viral accumulation, with PepMV infection being more productive at the lower temperature (20ºC versus 30ºC). In turn, infection time also played a role in the interaction between PepMV-EU and PepMV-CH2, since at long post-inoculation times the antagonistic interaction between both isolates was no longer observed. Regarding the mutational load, the average number of variants in viral populations increased significantly with temperature, being in turn isolate-dependent. The role of super-infections in the asymmetric antagonism shown by PepMV-EU and PepMV-CH2 was also studied. PepMV-EU had a protective effect against PepMV-CH2 super-infection, however, PepMV-EU accumulation was increased in plants pre-inoculated with PepMV-CH2. Regarding the effect of the type of infection (single or mixed) on viral transmission, a strong positive correlation was observed between viral accumulation and transmission, regardless of the type of infection in the inoculum source. The genetic diversity of PepMV-EU and PepMV-CH2 in single and mixed infections was also analysed in a serial passaging assay. For PepMV-EU, no significant differences were found in the average number of nucleotide substitutions between single and mixed infections. However, a higher number of substitutions was found in single PepMV-CH2 infections compared to mixed infections. Comparing PepMV-EU and PepMV-CH2, a higher nucleotide diversity was found for PepMV-CH2 population in planta. Finally, in an attempt to understand the mechanism(s) underlying the virus-virus interaction between PepMV-EU and PepMV-CH2, a transcriptomic analysis of tomato plants infected with PepMV-EU, PepMV-CH2 or both, was carried out. First, transcriptomes of single infected plants were compared, showing that each viral strain differentially modulated the host transcriptome and that the most pronounced alterations occurred at early times post-infection. It was also shown that the host transcriptome response to mixed infections differed from single infections at late post-inoculation times. A search for host genes that could potentially be involved in the antagonism between PepMV-EU and PepMV-CH2 was performed. It was found that AGO1a, AGO2a, DCL2b and DCL2d genes, which are involved in the antiviral silencing pathway, were upregulated during PepMV-EU infection, but not during PepMV-CH2 infection, at early post-infection times. The pattern of AGO2a expression was validated in tomato and Nicotiana benthamiana plants; however, N. benthamiana ago2 mutant plants, while hyper-susceptible to PepMV, did not show a change in the trend of the antagonistic interaction between the isolates of the two PepMV strains.