Impact of melon EIF4E editing on virus resistance and melon fertility

Abstract

En este trabajo se ha estudiado el impacto de la edición del gen que codifica el factor de iniciación de la traducción eucariota (eIF) 4E sobre la susceptibilidad a virus y la fertilidad de la flor masculina en melón. EIF4E es una proteína de unión a cap que, a través de su interacción con eIF4G, constituye el núcleo del complejo eIF4F, el cual desempeña un papel clave en la circularización de los ARN mensajeros y su posterior traducción cap-dependiente. Además de su papel fundamental en la traducción de ARNm en eucariotas, eIF4E ha sido descrito como factor de susceptibilidad a virus de plantas, ya que puede ser reclutado por estos, permitiendo el establecimiento de la infección. Más allá de su papel en la traducción canónica de los ARNm celulares, se han sugerido otras funciones para eIF4E en la biología de los organismos eucariotas, incluido el desarrollo sexual. En la primera sección de los resultados, se describe la generación de un mutante knock-out de EIF4E mediante CRISPR/Cas9. Las líneas mutantes T0 mostraron una deleción de un solo nucleótido en homocigosis que dio lugar a una proteína eIF4E truncada; además, la supresión de EIF4E originó un fenotipo de androesterilidad. El cruce entre plantas transgénicas homocigotas para la mutación con plantas de tipo silvestre del mismo genotipo dio lugar a una generación F1 que incluía individuos no transgénicos que presentaban la misma deleción que en la T0, pero en heterocigosis. A continuación, se fecundaron individuos F1 fértiles no transgénicos para obtener una generación F2 libre de transgen. Las plantas de la generación F2 fueron inoculadas con el virus del mosaico de la sandía marroquí (MWMV); las plantas homocigotas para la mutación de EIF4E mostraron resistencia al virus, mientras que las plantas heterocigotas y las no mutantes mostraron síntomas de la enfermedad. Tras cuatro meses desde la inoculación, se observaron síntomas de infección por MWMV en dos de las plantas resistentes. Estas plantas sintomáticas fueron positivas para MWMV por RT-qPCR, por lo que se realizó un ensayo de retroinoculación que confirmó la presencia de un aislado que superaba la resistencia (RB). A continuación, se amplificó por RT-PCR el gen de la VPg del MWMV y se identificó una única sustitución de un nucleótido que daba lugar al cambio de aminoácido N163Y en el aislado RB. Dados los antecedentes publicados sobre la superación de la resistencia mediada por el eIF4E en potyvirus, es muy probable que la mutación N163Y en la VPg del MWMV sea la responsable de la superación de la resistencia de las plantas editadas de melón. En cuanto a la fertilidad, todas las plantas homocigotas, y sólo ellas, mostraron el fenotipo de esterilidad masculina observado en T0. En el segundo apartado de los resultados de este trabajo, se realizó el análisis morfológico y transcriptómico de las flores de melón en diferentes etapas de desarrollo. En primer lugar, se analizó la morfogénesis de las flores masculinas y hermafroditas, identificando mediante microscopía óptica y de barrido 12 estadios de formación floral, que van desde la aparición de los meristemos florales hasta la antesis. Las primeras diferencias estructurales entre las flores masculinas y hermafroditas aparecieron entre los estadios 6 y 7, por lo que se ha llevado a cabo una descripción de las etapas que conducen a la formación de los órganos y estructuras en ambos tipos de flores. Por último, se identificaron los patrones de expresión de los genes que son específicos de un episodio determinado, identificando aquellos que definen el paso de un episodio al siguiente según el modelo ABCDE de desarrollo floral. En la tercera parte de este trabajo, se llevó a cabo un análisis comparativo del desarrollo floral masculino entre las plantas de tipo silvestre y las mutantes knock-out de EIF4E, con el fin de investigar el papel de EIF4E en la formación de los gametos masculinos del melón. El análisis comparativo de las anteras realizado mediante microscopía mostró que el fenotipo de esterilidad es post-meiótico y esporofítico, ya que la inusual secreción de material proteico, y las diferencias en la degradación del tapetum entre el mutante y el WT, son característicos de este tipo de esterilidad. En consonancia con esto, los datos transcriptómicos identificaron una regulación a la baja de los genes implicados en el desarrollo del tapetum y en la germinación del polen en las flores masculinas del mutante de EIF4E frente al WT. Por último, EIF4G mostró un patrón de regulación a la baja a lo largo del desarrollo floral masculino en el mutante con respecto al WT. Dada la evidencia que apoya un papel diferencial de las isoformas de eIF4F en la traducción de los mRNAs en las células germinales, se propuso que la interacción entre eIF4E y eIF4G es un requisito previo para la traducción de los mRNAs que codifican las proteínas que limitan la formación de los gametos masculinos.

In this work, the impact of editing the gene encoding the eukaryotic translation initiation factor (eIF) 4E of melon has been studied in relation to virus susceptibility and male flower fertility. The cap-binding protein eIF4E, through its interaction with eIF4G, constitutes the core of the eIF4F complex, which plays a key role in the circularisation of mRNAs and their subsequent cap-dependent translation. In addition to its fundamental role in mRNA translation in eukaryotes, eIF4E has been widely described as a plant virus susceptibility factor, as it can be recruited by numerous viruses and enable the establishment of infection by participating in fundamental processes for the virus, as is translation of viral mRNAs. Beyond its involvement in the canonical translation of cellular mRNAs, other functions have been suggested for eIF4E in the biology of eukaryotic organisms, including sexual development. In the first section of the results, the generation of an eif4e knock-out mutant through CRISPR/Cas9-mediated genome editing is described. The T0 mutant lines showed a single nucleotide deletion in homozygosis that resulted in a putative truncated eIF4E protein; importantly for this thesis, the suppression of eIF4E originated a male sterility phenotype. The crossing between transgenic plants homozygous for the mutation with wild type (WT) plants of the same genotype gave rise to a F1 generation which included non-transgenic individuals that presented the same single deletion as the T0, but in heterozygosis. Next, fertilised non-transgenic fertile F1 individuals were produced to obtain a totally transgene-free F2 generation. Homozygous plants of the segregating F2 generation were inoculated with Moroccan watermelon mosaic virus (MWMV) and showed virus resistance, while heterozygous and non-mutant plants showed symptoms of virus infection. After four months from inoculation, symptoms of MWMV infection were observed in 2 of the resistant plants. Symptomatic plants tested positive for MWMV by RT-qPCR, therefore a back-inoculation assay was performed confirming the presence of a resistance breaking (RB) isolate. I then RT-PCR-amplified the MWMV VPg cistron and identified a single nucleotide substitution leading to the single amino acid change N163Y for the RB isolate. Given the antecedents published on potyvirus eIF4E-mediated resistance-breaking, it is very likely that the mutation N163Y in the MWMV VPg is responsible for overcoming the resistance of melon edited plants. Regarding fertility, all homozygous plants, and only homozygous plants, showed the male-sterility phenotype observed in T0, showing a perfect correlation between the segregation of the male sterility phenotype and the segregation of the eIF4E mutation. In the second section of the results of this work, morphological and transcriptomic analysis of melon flowers were performed at different stages of development. First, I analysed the morphogenesis of male and hermaphrodite melon flowers, identifying by optical and scanning microscopy 12 stages of floral formation, ranging from the appearance of floral meristems to anthesis. The first structural differentiations between male and hermaphrodite flowers appeared between stages 6 and 7 and I described in detail the stages leading to the formation of floral organs and structures in both flower types. Finally, through the processing of the transcriptomic data, and establishing a correlation between developmental stages and episodes grouping some of them, I identified the patterns of expression of the differently expressed genes that are specific to a given episode of floral development, identifying the genes that determine the passage from one episode to the next according to the ABCDE model of flower development. In the third part of this work, I conducted a comparative analysis of melon male floral development between wild type and eif4e knock out mutant plants in order to investigate the role of eIF4E in the formation of male melon gametes. The comparative analysis of anther structures carried out by microscopy showed the sterility phenotype to be post-meiotic and sporophytic, as the unusual secretion of protein material at early stages, and the differences in the timing of tapetum degradation at late stages between the mutant and the WT are characteristic to this type of sterility. Consistent with this, the transcriptomic data identified a general down-regulation of genes involved in tapetal development and pollen germination in eif4E mutant versus WT male flowers. Finally, eIF4G showed a down regulation pattern in three out of four episodes in male floral development in the mutant with respect to the WT. Given the evidence supporting a differential role for eIF4F isoforms in the translation of mRNAs in germ cells, we proposed the interaction between eIF4E and eIF4G to be a prerequisite to specifically initiate translation of mRNAs encoding proteins limiting male gametes formation.