Expanding the continuum of antithrombin deficiency : new insights on this severe thrombophilia via the comprehensive analysis of cases in atypical or emerging clinical scenarios

Abstract

INTRODUCCIÓN. La antitrombina es un anticoagulante que juega un papel clave en la hemostasia. La deficiencia de antitrombina (actividad <80%) es un estado trombofílico grave. Se han descrito más de 400 variantes en SERPINC1, el gen que codifica la antitrombina. La caracterización de muchas de estas variantes ha generado un vasto conocimiento. OBJETIVOS. Descifrar nuevos mecanismos implicados en deficiencia de antitrombina mediante la caracterización de casos en escenarios atípicos/emergentes, con cuatro líneas de investigación específicas: 1. Identificar y caracterizar casos con deficiencia de antitrombina transitoria. 2. Evaluar la frecuencia de defectos del sistema de la vena cava inferior en pacientes homocigotos para la variante antitrombina Budapest3 (p.Leu131Phe). 3. Caracterizar una familia con deficiencia de antitrombina y un fuerte historial de muertes embriofetales. 4. Analizar la asociación entre las trombofilias hereditarias y las complicaciones de la COVID-19. MÉTODOS. Estudio de una cohorte de 444 casos con deficiencia de antitrombina, 1998-2021. La antitrombina se caracterizó por métodos funcionales y bioquímicos. SERPINC1 se estudió mediante secuenciación y amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples. En la línea de investigación 1, definimos casos con deficiencia transitoria de antitrombina aquellos que alternaban valores funcionales normales y defectuosos. En la línea 2, seleccionamos casos homocigotos para antitrombina Budapest3, de entre 1118 pacientes (casos índice y familiares) procedentes de dos cohortes (España, N=692; Hungría, N=426). En la línea 3, nos centramos en una familia con deficiencia de antitrombina y un fuerte historial de muertes embriofetales. En la línea 4 se siguieron dos diseños para identificar casos con trombofilia e infección por SARS-CoV-2: 1) búsqueda de casos con infección por SARS-CoV-2 en sujetos con diagnóstico previo de deficiencia de antitrombina (N=331), y 2) exoma completo de pacientes <75 años hospitalizados con neumonía SARS-CoV-2 (N=87). RESULTADOS. Resultados de cada línea de investigación: 1. Un total de 139 casos presentaron deficiencia transitoria de antitrombina, y 61 (43,9%) tenían defectos moleculares: 48 con variantes en SERPINC1 y 13 con hipoglicosilación. Dos mecanismos principales explicaron la deficiencia transitoria: la limitación de los métodos funcionales para detectar algunas variantes y la influencia de factores externos en las consecuencias patogénicas de estas mutaciones. 2. Veinticuatro de 61 sujetos homocigotos Budapest3 presentaban una prueba de imagen disponible. Se observó atresia del sistema de la vena cava inferior en 17 (70,8%) de estos casos. El análisis de microsatélites apoyó la asociación específica de esta malformación vascular con la variante en SERPINC1. 3. Se identificaron dos mutaciones diferentes en esta familia: una variante cuantitativa grave (c.1154-14G>A) y antitrombina Budapest3. La caracterización molecular de un embrión muerto reveló una heterocigosis compuesta para las variantes, lo que pudo provocar letalidad embrionaria. 4. Se identificaron 15 pacientes con trombofilia e infección SARS-CoV-2. Se encontraron niveles elevados de dímero D al ingreso en pacientes con trombofilia grave. Los pacientes con antecedentes trombóticos previos (N=5), todos anticoagulados, no desarrollaron trombosis sintomática durante la infección. Un paciente con deficiencia de proteína C recién identificado, sin antecedentes trombóticos, presentó una embolia pulmonar dos días después del ingreso hospitalario. CONCLUSIONES. La deficiencia de antitrombina es una enfermedad infraestimada. Hemos ampliado el continuo clínico y molecular de la deficiencia de antitrombina: desde las deficiencias transitorias hasta las malformaciones vasculares y la letalidad embrionaria. Se han identificado nuevas formas y mecanismos de deficiencia de antitrombina. Finalmente, la infección por SARS-CoV-2 se ha confirmado como un desencadenante protrombótico emergente; pacientes con esta y otras trombofilias pueden ser una población de alto riesgo. En conjunto, este trabajo destaca la importancia del análisis molecular de la deficiencia de antitrombina, no solo para una mejor comprensión de la biología de la trombosis, sino también en términos de implicaciones clínicas.

INTRODUCTION. Antithrombin is an anticoagulant serpin that plays a key role in haemostasis. Antithrombin deficiency (activity<80%) is a severe thrombophilic state. More than 400 variants have been described in SERPINC1, the gene encoding antithrombin. Characterization of many of these variants has generated plenty of knowledge. AIMS. To decipher new mechanisms involved in antithrombin deficiency by the characterization of cases in atypical/emergent scenarios, with four specific lines of research: 1. To identify and characterize cases with transient antithrombin deficiency. 2. To assess the frequency of inferior vena cava defects in patients homozygous for antithrombin Budapest 3 (p.Leu131Phe). 3. To characterize a family with antithrombin deficiency and a strong history of embryo-foetal deaths. 4. To analyse the association between inherited thrombophilias and COVID-19 complications. METHODS. Study of a cohort of 444 unrelated cases with antithrombin deficiency, recruited from 1998 to 2021. Plasma antithrombin was characterized by functional and biochemical methods. SERPINC1 was studied by Sanger’s or next generation sequencing and multiplex ligation-dependent probe amplification. In line of research 1, we defined cases with transient antithrombin deficiency as those that alternated normal and defective functional values of antithrombin. In line 2, we selected cases homozygous for antithrombin Budapest 3, from 1118 patients (index cases and relatives) from two different cohorts (Spain, N=692; Hungary, N=426) for abdominal image exam. In line 3, we focused on a family with antithrombin deficiency and a strong history of embryo-foetal deaths. In line 4, two designs were followed to identify cases with thrombophilia and SARS-CoV-2 infection: 1) retrospective analysis of SARS-CoV-2 infection in subjects with prior diagnosis of antithrombin deficiency (N=331), and 2) whole exome sequencing of patients <75 years old hospitalized with SARS-CoV-2 pneumonia (N=87). RESULTS. The results of each line of research are summarized: 1. A total of 139 cases from our cohort presented transient antithrombin deficiency, and 61 (43.9%) of them had molecular defects: 48 had SERPINC1 variants, and 13 had hypoglycosylation. Two main mechanisms explained transient deficiency: the limitation of current functional methods to detect some variants and the influence of external factors on the pathogenic consequences of these mutations. 2. Twenty-four of 61 homozygous Budapest 3 subjects recruited had an available image exam. Atresia of the inferior vena cava system was observed in 17 (70.8%) of these cases. Short tandem repeat analysis supported the specific association of the vascular malformation with the SERPINC1 variant. 3. Two different mutations were identified in this family: a severe quantitative variant (c.1154-14G>A), and antithrombin Budapest 3. Molecular characterization of a dead embryo revealed a compound heterozygosis for the variants, which may have led to extremely severe antithrombin deficiency and embryonic lethality. 4. Fifteen patients with thrombophilia and SARS-CoV-2 infection were identified. Increased at-admission levels of D-dimer were found in patients with severe thrombophilia. Patients with prior thrombotic history (N=5), all on anticoagulant therapy, did not develop symptomatic trombosis during infection. In contrast, one newly identified protein C-deficient patient, without thrombotic history, had a pulmonary embolism two days after hospital admission. CONCLUSIONS. Our work demonstrated that antithrombin deficiency is underestimated. We have expanded the clinical and molecular continuum of antithrombin deficiency: from the surreptitious behaviour of transient deficiencies to vascular malformations and embryonic death in the most extreme cases with compound SERPINC1 defects. Novel forms and mechanisms of antithrombin deficiency have been identified. Finally, SARS-CoV-2 infection has been confirmed as an emergent prothrombotic trigger for which patients with this and other inherited thrombophilias may be a high-risk population. Altogether, this work highlights the importance of the molecular analysis of antithrombin deficiency, not only for a better understanding of thrombosis biology, but also in terms of clinical implications.