Control ambiental de la división y diferenciación celular en levaduras con fisión

Abstract

Las rutas de señalización intracelular mediadas por las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), juegan un papel fundamental en las células eucariotas durante la respuesta adaptativa frente a cambios ambientales y condiciones adversas. El citoesqueleto de actina constituye una compleja red de polímeros que desempeñan un papel esencial durante la ejecución de procesos fundamentales para la célula como son la motilidad, la endocitosis, el crecimiento polarizado y la citocinesis. El correcto ensamblaje y organización de los polímeros de actina depende en gran medida de la activación y/o inhibición coordinada de un elevado número de proteínas evolutivamente muy conservadas que participan en diferentes cascadas de señalización, incluyendo las rutas de señalización mediadas por MAPKs. La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe constituye un excelente modelo para el estudio de los mecanismos que activan dichas rutas, así como de los procesos que estas regulan, pues su genoma está evolutivamente muy conservado en relación con el de eucariotas superiores, y además presenta una gran versatilidad para la realización de estudios genómicos, bioquímicos, y celulares. Sin embargo, aunque tradicionalmente se ha empleado a S. pombe como organismo modelo en investigación, en los últimos años también está adquiriendo gran relevancia Schizosaccharomyces japonicus, otra de las cuatro especies que componen este género. S. japonicus fue la primera especie en distanciarse evolutivamente de las demás especies del género, y, a pesar de no ser patógeno, es un organismo dimórfico que puede crecer como levadura o diferenciarse para formar hifas en respuesta a distintas señales ambientales. S. pombe y S. japonicus también muestran diferencias notables en procesos biológicos tales como la remodelación de la envuelta nuclear durante la mitosis, el posicionamiento del plano de división, o la regulación de la polaridad celular. En base a estas y otras diferencias, ambas especies de levadura constituyen modelos óptimos para la realización de estudios evolutivos en el campo de la biología celular. Así, la presente Tesis Doctoral se ha focalizado en la caracterización funcional de las rutas de MAPKs de respuesta a estrés (SAPK) y de integridad celular (CIP) en las levaduras de fisión desde un punto de vista evolutivo, y su posible papel como reguladores de la morfogénesis. Para ello he planteado el abordaje de dos objetivos fundamentales: 1. Conservación evolutiva de las rutas de MAP quinasas activadas por estrés y de integridad celular en el género Schizosaccharomyces, y su papel como reguladores del dimorfismo en S. japonicus. 2. El estudio de las MAPKs activadas por estrés como reguladoras de la integridad del citoesqueleto de actina y la citocinesis en levaduras del género Schizosaccharomyces. Para la consecución de los objetivos anteriormente descritos se han empleado tanto cepas silvestres como distintos mutantes de S. pombe y S. japonicus obtenidos mediante manipulación genética o procedentes de otras fuentes (grupos de investigación y colecciones de cepas), así como diferentes técnicas experimentales. Estas incluyen: i- la construcción de cepas mutantes de levadura mediante manipulación genética (deleciones; mutagénesis dirigida; fusión de genes a epítopos específicos), ii- técnicas de biología molecular (PCR; qPCR; análisis RNAseq), iii- análisis de proteínas (marcaje y purificación de proteínas; SDS-PAGE; detección del estado de fosforilación y de los niveles de proteína mediante Western blot; inmunoprecipitación; ensayos de fosforilación in vivo/in vitro; tecnología PhosTag), y iv- técnicas de microscopía (microscopía time-lapse de fluorescencia de tipo confocal y wide-field). Los resultados obtenidos durante la realización de esta Tesis has permitido extraer las siguientes conclusiones: - La arquitectura del módulo de MAPKs de integridad celular se encuentra fuertemente conservada en S. pombe y S. japonicus, mientras que los activadores aguas arriba del módulo, los ortólogos de PKC Pck1 y Pck2, regulan antagónicamente la transición dimórfica en S. japonicus mediante el control preciso de la actividad de la MAPK Pmk1. Además, en S. japonicus Pmk1 posee una estructura secundaria única evolutivamente diferente que permite que la señalización mediada por la ruta CIP cumpla con los requisitos específicos de desarrollo de esta especie de levadura de fisión. - S. japonicus presenta un mecanismo de percepción del quórum dependiente de la densidad celular mediado por la liberación de alcoholes aromáticos que, junto con la ruta de MAPKs activada por estrés (SAPK), modula negativamente la transición dimórfica levadura-hifa en respuesta a estímulos ambientales. - La ruta de MAPKs activada por estrés (SAPK) regula negativamente el ensamblaje del anillo contráctil de actomiosina (CAR) en S. pombe mediante la reducción de los niveles de proteína de la formina For3 en respuesta a daños en el citoesqueleto de actina inducidos con Latrunculina A. Por el contrario, esta ruta modula de forma positiva el ensamblaje del CAR en S. japonicus, reflejando así la adaptación evolutiva que dicha cascada de señalización ha experimentado en respuesta a las marcadas diferencias que existen entre ambas levaduras de fisión en cuanto a la ejecución de la citocinesis.

In eukaryotic cells the evolutionarily conserved mitogen-activated protein kinase (MAPKs) signaling pathways play an essential role during the adaptive response to environmental cues. The actin cytoskeleton is a complex network of polymers that plays a fundamental role in the regulation of cellular processes such as motility, endocytosis, polarity, and cell division. The correct assembly and organization of actin polymers depends to a large extent on the coordinated activation and/or inhibition of many conserved proteins through different signaling cascades, including MAPKs. The rod-shaped fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been established as an excellent model organism to study the mechanisms that activate MAPKs pathways and other cellular processes, since its genome is evolutionarily conserved as compared to higher eukaryotes, and it is also highly versatile for genomic, biochemical, and cell biology analyses. Nevertheless, although S. pombe has traditionally been used as the prototype fission yeast model, Schizosaccharomyces japonicus, another of the four species in this genus, is gradually becoming an attractive model in recent years. S. japonicus was the first species to diverge evolutionarily from the remaining species in the genus and, despite being non-pathogenic, it is a dimorphic organism that can grow as a yeast or differentiate to form hyphae in response to different environmental cues. S. pombe and S. japonicus also show distinctive features in key biological processes such as nuclear envelope remodeling during mitosis, division plane positioning, or cell polarity regulation. Based on these and other differences, both yeast species are optimal models for evolutionarily-related cell biology studies. Thus, the present Thesis has focused on the functional characterization of the stress-activated (SAPK) and cell integrity (CIP) MAPKs pathways in both fission yeasts from an evolutionary point of view, and their putative role as regulators of morphogenesis. To this end, I have addressed two essential objectives: 1. To study the evolutionary conservation of the stress-activated and cell integrity MAP kinase signaling pathways within the genus Schizosaccharomyces and their role during dimorphism in S. japonicus. 2. To investigate the role of stress-activated MAPKs as modulators of the integrity of the actin cytoskeleton and cytokinesis within the genus Schizosaccharomyces. To achieve the above objectives, I have employed both wild type and mutant S. pombe and S. japonicus strains obtained either by genetic manipulation or from alternative sources (i.e. from another research groups or strains collections), as well as different experimental techniques. These included: i-the construction of mutant yeast strains by genetic manipulation (gene deletion; site-directed mutagenesis; gene fusion to specific epitope tags), ii- molecular biology techniques (PCR; qPCR; RNAseq analysis), iii- protein analysis (protein tagging and purification; SDS-PAGE; detection of protein phosphorylation status and levels by Western blot; immunoprecipitation; in vivo/in vitro phosphorylation assays; PhosTag technology), and iv- microscopic techniques (confocal and wide-field fluorescence time-lapse microscopy). From the results obtained in this Thesis, the following general conclusions can be proposed: - The cell integrity MAPK module architecture is strongly conserved in S. pombe and S. japonicus, while the upstream activators Pck1 and Pck2 antagonistically regulate S. japonicus dimorphic switch through the precise control of the activity of MAPK Pmk1. Moreover, S. japonicus Pmk1 possesses a unique and evolutionarily distinct secondary structure that allows CIP signaling to comply with the specific developmental requirements of this fission yeast species. - S. japonicus features a cell density-depending quorum sensing mechanism mediated by aromatic alcohols that, together with the stress-activated MAPK pathway, negatively modulates the yeast to hyphae transition dimorphic switch in response to environmental changes. - The SAPK pathway negatively regulates the assembly of the contractile actomyosin ring (CAR) in S. pombe by decreasing the protein levels of the formin For3 in response to cytoskeletal damage induced with Latrunculin A (LatA). On the contrary, SAPK signaling positively contributes to CAR assembly in S. japonicus, thus reflecting the evolutionary adaptation of this signaling cascade to the marked differences in the execution of cytokinesis in both fission yeast species.