Optimization of toxicological and forensic tools in the investigation of wildlife poisoning

Abstract

El envenenamiento es una actividad ilegal considerada como una preocupante causa de muerte de fauna silvestre. El examen post mortem (PM) y el análisis toxicológico son esenciales para un diagnóstico adecuado por envenenamiento. El objetivo principal de esta tesis es proporcionar herramientas toxicológicas y forenses para mejorar el diagnóstico de causa de muerte por envenenamiento de la fauna silvestre. Para ello se plantearon cinco objetivos específicos. El primer objetivo es buscar datos complementarios forenses para clasificar el grado de descomposición de los cadáveres utilizando una especie de rapaz de pequeño tamaño como modelo. Para ello, 12 cadáveres de cernícalo común (Falco tinnunculus) fueron expuestos a condiciones climáticas externas. Se realizaron necropsias a 1-2 h, 24 h, 72 h, 96 h, 7 y 15 días después de la muerte. Se seleccionaron seis etapas del proceso autolítico PM: cadáver fresco, descomposición moderada, descomposición avanzada, descomposición muy avanzada, reducción esquelética inicial y reducción esquelética completa. Se diseñó un método de puntuación para clasificar el grado de descomposición considerando 5 parámetros: estado de los globos oculares, lengua y cavidad oral, músculo pectoral, órganos internos y otras características. Este nuevo protocolo pretende armonizar la clasificación de las fases de descomposición de los cadáveres, y facilitar la estimación de la data de la muerte en futuras investigaciones. El segundo objetivo es evaluar la degradación de compuestos tóxicos en cadáveres envenenados utilizando bromadiolona y cernícalo común como especie modelo. Se administraron 55 mg/kg p.c. de bromadiolona a seis individuos adultos. Las concentraciones hepáticas en cada etapa de descomposición fueron: 3000, 2891, 4804, 4245, 8848 y 756 ng/g p.s. a 1-2 h, 24 h, 72 h, 96 h, 7 y 15 días después de la muerte, respectivamente. La bromadiolona persiste en el hígado de los cadáveres de cernícalo varios días después de la muerte. Por lo tanto, los cadáveres en el campo pueden ser una fuente de envenenamiento secundario o terciario para los carroñeros, al menos durante la primera semana después de la muerte (en condiciones climáticas similares a las del estudio). Se necesitan más estudios para evaluar la degradación de los venenos en los cadáveres bajo diferentes situaciones (días adicionales de descomposición, mayor variedad de condiciones climáticas y especies de diferentes tamaños). El tercer objetivo es recopilar y comparar los procedimientos analíticos aplicados para la determinación de rodenticidas anticoagulantes (RA) en la literatura. Utilizando esta información, se desarrolló un sistema de puntuación para las técnicas que utilizan hígado y sangre como matrices. Las técnicas se clasificaron considerando diferentes criterios. Esta revisión ayudará a mejorar las técnicas multiresiduo para detectar RA involucrados en el envenenamiento de la fauna silvestre. La información recopilada muestra que se utilizan diferentes matrices y métodos analíticos. Aunque el uso de la misma metodología no es obligatorio para lograr resultados comparables entre laboratorios, las comparaciones interlaboratorio son fundamentales para garantizar la eficacia de las técnicas. El cuarto objetivo es llevar a cabo una un estudio interlaboratorio en los cuatro laboratorios de referencia en toxicología forense veterinaria en España, comparando los procedimientos analíticos utilizados para detectar compuestos tóxicos implicados en el envenenamiento de la fauna silvestre. Los resultados muestran que las diferentes técnicas aplicadas para analizar carbamatos, organofosforados y RA son adecuadas y comparables. Estos laboratorios son capaces de proporcionar resultados fiables utilizando pequeñas cantidades de muestra y técnicas más económicas y respetuosas con el medio ambiente. El quinto y último objetivo es iniciar los pasos para poner en marcha una red europea de laboratorios de toxicología veterinaria forense que luchen contra el envenenamiento de la fauna silvestre. Se ha contactado con diferentes laboratorios e instituciones europeas y se les ha pedido que rellenen un cuestionario sobre diferentes temas. Se recibieron un total de 28 respuestas. Debería compartirse información adicional para mejorar las metodologías de la red. La creación de la red ayudaría a armonizar las metodologías y a aumentar las capacidades paneuropeas. Se necesitan más laboratorios y/o instituciones para abarcar un espacio europeo más amplio.

Poisoning is an illegal activity reported as a cause of death of special concern in wildlife. Post-mortem (PM) examination and toxicological analysis are essential for a proper diagnosis of poisoning. The general aim of this thesis is to provide toxicological and forensic tools to improve the fight against wildlife poisoning, and five specific objectives were selected. The first objective is to seek complementary forensic data to classify the stages of carcass decomposition using a small-sized raptor species (SRS) as model. For this purpose, 12 carcasses of Common kestrel (Falco tinnunculus) were exposed to external weather conditions. Necropsies were performed at 1-2 h, 24 h, 72 h, 96 h, 7 and 15 days after death. Six stages of the PM autolytic process were selected: fresh carcass, moderate decomposition, advanced decomposition, very advanced decomposition, initial skeletal reduction and complete skeletal reduction. A scoring method was designed to classify the stages of carcass decomposition considering 5 parameters: state of the eyeballs, tongue and oral cavity, pectoral muscle, internal organs and other features. This novel protocol intends to harmonise the classification of the stage of carcass decomposition and will facilitate the estimation of the time of death in future research. The second objective is to evaluate the degradation of toxic compounds in poisoned carcasses using bromadiolone and a SRS as models. Six Common kestrels were dosed with 55 mg/kg b.w. of bromadiolone. Hepatic concentrations in each stage of decomposition were: 3000, 2891, 4804, 4245, 8848, and 756 ng/g d.w. at 1–2 h, 24 h, 72 h, 96 h, 7 and 15 days after death, respectively. Bromadiolone persists in the liver of carcasses of SRS several days after death. Therefore, carcasses in the field may be a source of secondary or tertiary poisoning for scavengers, at least during the first week after death (under similar weather conditions of the study). Further studies to assess poison degradation in carcasses under different scenarios (additional days of decomposition, broader variety of weather conditions and species of different sizes) are needed. The third objective is to compile and compare the analytical procedures applied for anticoagulant rodenticide (AR) determination in the literature. Using this information, a scoring system was developed for those techniques using liver and blood as matrices, and the techniques were ranked considering different criteria. This review will help to elucidate future directions to improve multi-residue techniques to detect AR involved in wildlife poisoning. Information gathered shows that different matrices and a variety of analytical methods are used. Although the use of the same methodology is not mandatory to achieve comparable results across laboratories, interlaboratory comparisons are critical to ensure an adequate performance. The fourth objective is to carry out the comparison of the performance of analytical procedures applied to detect toxic compounds involved in wildlife poisoning in four reference laboratories in veterinary forensic toxicology in Spain. The results show that the different techniques applied to analyse carbamates, organophosphates and AR are appropriate and can obtain comparable results. These laboratories are able to provide reliable results using small sample amounts and more economic and environmentally friendly techniques. The fifth and final objective is to carry out the first steps to start a European network of laboratories in forensic veterinary toxicology to fight against wildlife poisoning. Different European laboratories and institutions have been contacted and asked to fill a questionnaire about different topics. A total of 28 replies were received. Additional information should be shared to improve methodologies in the network. The creation of the network will help to harmonise methodologies and increase pan-European capacities. More laboratories and/or institutions are needed to cover a wider European area.