Estudio de la degeneración de los fotorreceptores, epitelio pigmentario de la retina y de la reacción microglial en un modelo de fototoxicidad focal con led y neuroprotección en roedor

Abstract

Objetivos Los objetivos generales de esta tesis son los siguientes: 1. Estudiar “in vivo” en la rata albina adulta el curso temporal de la lesión focal fototóxica en la retina y caracterizar “ex vivo” la reacción microglial en la capa de los segmentos externos de los fotorreceptores (SEF). 2. Caracterizar en la retina del ratón pigmentado adulto la degeneración de los fotorreceptores en un nuevo modelo de fototoxicidad focal con LED (FFL). 3. Estudiar la supervivencia de cono, la reacción microglial asociada y el epitelio pigmentario de la retina tras la fotoexposición focal con LED en ratones pigmentados tratados con bFGF y minociclina administrada de forma aislada o combinada. Material y métodos Para la realización de los experimentos se utilizaron ratas albinas adultas hembras y ratones pigmentados adultos hembras. Las manipulaciones de los animales se realizaron siguiendo la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD 53/2013) vigente sobre la protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Para el estudio “in vivo” del curso temporal de la lesión focal fototóxica las retinas se examinaron mediante tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) a las 24 horas, a los 3, 5, 7, 14, 30 días de la fotoexposición focal con LED (FFL). Para caracterizar “ex vivo” la reacción microglial en la capa de los segmentos externos de los fotorreceptores (SEF) en la rata albina adulta, las retinas de los animales fueron inmunodetectadas con dos anticuerpos, anti-OPN1SW para la detección de los conos S y anti-Iba-1 para la detección de células de la microglía. Para el estudio de la cuantificación de los conos arrestina+ y su distribución en la retina del ratón pigmentado las retinas a plano y las secciones transversales se inmunodetectaron mediante un anticuerpo anti-arrestina, anti-OPN1SW y anti-opsina-L. Para el estudio “in vivo” de la lesión producida por la FFL los ratones pigmentados fueron estudiados mediante SD-OCT a 1, 3, 5 y 7 días de la FFL. Para el análisis “ex vivo” de la degeneración de los conos tras FFL se establecieron 4 grupos de animales de 6 ratones cada uno que fueron analizados a 1, 3, 5 y 7 días tras la FLL y se inmunodetectaron los conos mediante un anticuerpo frente a arrestina. Para el estudio de supervivencia de conos, la reacción microglial asociada y del epitelio pigmentario de la retina (EPR) tras la fotoexposición focal LED en ratones pigmentados tratados con bFGF y minociclina administrada de forma aislada o combinada, las retinas de los animales fueron estudiados mediante SD-OCT e inmunohistoquímica a 3 y 7 días tras la FFL. Para el estudio mediante inmunohistoquímica se utilizaron los anticuerpos anti-arrestina para el estudio de conos, anti-Iba1 para el marcaje de la microglía y anti-ZO-1 para el estudio del EPR. Para el análisis estadístico se utilizó One Way ANOVA o Kruskal Wallis para la comparación de más de dos grupos y t-test para la comparación de dos grupos. Resultados

El estudio “in vivo” mediante SD-OCT de la evolución del daño retiniano tras una FFL en la retina de la rata albina mostró una lesión redondeada localizada en el cuadrante superotemporal de la retina en la que se observó una atrofia progresiva de la retina circunscrita a esta lesión. El espesor medio total de los ojos derechos fue de 192,3 ± 3,8 µm mientras que el espesor de la retina externa fue de 104,7 ± 3,9 µm. A los 30 días de la FFL, el espesor de la retina total disminuyó hasta 102,8 ± 17,2 µm y el de la retina externa disminuyó hasta 10,2 ± 5,7 µm El análisis de la supervivencia de los segmentos externos de los conos S (SES+) en el área de la lesion en la retina de la rata albina adulta mostró un número total de SES+ de 2398 ± 388. Al día de la FFL, el número de SES+ en el ACC descendió significativamente a 1369 ± 364. A los 3 días el número SES+ se mantuvo para posteriormente disminuir progresivamente hasta los 14 días de la FFL, cuando el número de SES+ decayó un 85% en área de la leison y se mantuvo constante hasta los 30 días de la FFL. Tras la FFL, se observó la aparición de células Iba-1+ circunscritas al centro del área lesionada a las 24 horas de la FFL que se mantuvo hasta los 30 días de la FFL. La morfología de estas células cambió en los diferentes intervalos de estudio. El estudio de la cuantificación y distribución de los conos arrestina+ (SEa+) en la retina del ratón pigmentado mostró que el número total de SEa+ fue de 141.842 ± 11.288 (n=10). Estos presentaban un gradiente dorso-ventral creciente y alta densidad en la retina central frente a la periferia. El número de conos L (SEL+) y S (SES+) fue menor (131.172 ± 8.945 y 111.158 ± 9.805). El estudio de los cortes transversales de la retina mostró que el 99% de los conos L expresaban también arrestina, mientras que el 92% de los conos arrestina+ expresaban también opsina S. El estudio “in vivo” mediante SD-OCT tras una FFL en la retina del ratón pigmentado mostró una lesión en el cuadrante temporal superior de la retina. El espesor medio de la retina total de la retina del ratón pigmentado en los ojos derechos controles fue de 205,05 ± 4,2 µm (n=6), mientras que el espesor medio de la retina externa fue de 116,5 ± 2,88 µm. En el área de la lesión se observó una atrofia progresiva de la retina total hasta los 5 días de la FFL, cuando el espesor medio de la retina total fue de 127,15 ± 4,47 µm y se mantuvo constante hasta los 7 días de la FFL. El análisis “ex vivo” de la degeneración de los conos arrestina+ en el área de la lesión tras la FFL mostró una lesión circular en el cuadrante temporal superior cuya distancia al nervio óptico fue de aproximadamente 1 mm. El número de SEa+ de los ojos derechos controles en el área de la lesión fue de 6218 ± 341. El análisis de la degeneración de los SEa+ en la zona de la lesión reveló una degeneración progresiva de los SEa+ que fue significativa a los 3 días de la FFL (5516 ± 183) y continuó hasta los 7 días de la FFL cuando el número de SEa+ fue de 3966 ± 311. El estudio “in vivo” del espesor retiniano en el área de la lesión tras FFL y la administración de bFGF y minociclina de forma aislada o en combinación mostró que aquellas retinas tratadas con bFGF de forma aislada o en combinación presentaron una ralentización de la atrofia de la retina, a expensas de las capas externas, a los 5 días de la FFL en relación a las retinas tratadas con vehículos). Este efecto desapareció a los 7 días de la FFL. El estudio mediante inmunofluorescencia de la supervivencia de conos arrestina+ en las retinas tratadas con bFGF y minociclina de forma aislada o combinada reveló un efecto neuroprotector en el número de SEa+ del grupo tratado con bFGF y bFGF+minociclina a los 7 días de la FFL frente a sus vehículos. En el área de la lesión la microglía localizada en la capa plexiforme externa (CPE) reveló que aquellas retinas tratadas con terapias intravítreas presentaban entre 22-40% más de células de la microglía en el área de la lesión que aquellas que fueron tratadas con terapias intraperitoneales o retinas derechas controles. Sin embargo, las retinas tratadas con bFGF+minociclina presentaron un menor número de células de microglía en la CPE a los 7 días de la FFL. El análisis cualitativo de las células Iba-1+ en la capa de los segmentos externos de los fotorreceptores (SEF) localizadas en el área de la lesión tras la FFL reveló que en las retinas derechas controles la presencia de estas células es anecdótica. Sin embargo, tras la FFL se observó la aparición de células Iba-1+ en el área de la lesión cuya morfología fue distinta a los 3 días de la FFL, presentando un morfotipo más redondeado o ameboide que a los 7 días de la FFL cuando la morfología era más alargada. En las retinas tratadas con minociclina la presencia de estas células en la capa SEF fue menor que en aquellas tratadas con otras terapias. El estudio del EPR mostró que tras la FFL se produce una degeneración progresiva de las células del EPR, con disminución del número de células contenidas en el área de la lesión y alteraciones de su morfología. Los epitelios controles derechos mostraron un número de células del EPR en el área de 10.000 µm2 de estudio de 24,3 ± 3 células con un área media celular de 353,4 ± 124,4 µm2 (n=6). A los 7 días, el número de células del EPR decayó en torno a un 47% y se produjo un aumento del área media celular de los EPR. A los 3 días de la FFL, las retinas tratadas con bFGF y bFGF+minociclina conservaron el área media celular, Sin embargo, las terapias de bFGF y bFGF+minociclina no produjeron diferencias significativas en el número de células del EPR a los 3 y 7 días de la FFL.

Objectives The general objectives of this thesis are as follows: 1. To study "in vivo" in the adult albino rat the time course of focal phototoxic retinal injury and to characterize "ex vivo" the microglial reaction in the photoreceptor outer segment layer (FES). 2. To characterize in the adult pigmented mouse retina the degeneration of photoreceptors in a new model of focal LED phototoxicity (FFL). 3. To study cone survival, associated microglial reaction and retinal pigment epithelium after focal LED photoexposure in pigmented mice treated with bFGF and minocycline administered in isolation or in combination. Material and Methods. Adult female albino rats and adult female pigmented mice were used for the experiments. Animal manipulations were performed following the current European (Directive 2010/63/EU) and national (RD 53/2013) regulations on the protection of animals used for experimental and other scientific purposes. For the "in vivo" study of the time course of the phototoxic focal lesion the retinas were examined by spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT; Spectralis®, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany) at 24 hours, 3, 5, 7, 14, 30 days after focal LED photoexposure (FFL) To characterize "ex vivo" the microglial reaction in the photoreceptor outer segment layer (FES) in the adult albino rat, the retinas of the animals were immunodetected with two antibodies, anti-OPN1SW for detection of S cones and anti-Iba-1 for detection of microglia cells. For the study of the quantification of arrestin+ cones and their distribution in the pigmented mouse retina, flat retinas and transverse sections were immunodetected with an anti-arrestin, anti-OPN1SW and anti-opsin-L antibody. For in vivo study of FFL injury, pigmented mice were studied by SD-OCT at 1, 3, 5 and 7 days after FFL. For the ex vivo analysis of cone degeneration after FFL, 4 groups of 6 mice each were established and analyzed at 1, 3, 5 and 7 days after FFL and cones were immunodetected with an antibody against arrestin. For the study of cone survival, associated microglial reaction and retinal pigment epithelium (RPE) after focal LED photoexposure in pigmented mice treated with bFGF and minocycline administered alone or in combination, the retinas of the animals were studied by SD-OCT and immunohistochemistry at 3 and 7 days after FFL. For the study by immunohistochemistry, anti-arrestin antibodies were used for the study of cones, anti-Iba1 for the labeling of microglia and anti-ZO-1 for the study of the EPR. For statistical analysis, One Way ANOVA or Kruskal Wallis was used for comparison of more than two groups and t-test for comparison of two groups. Results The "in vivo" study by SD-OCT of the evolution of retinal damage after FFL in the albino rat retina showed a rounded lesion located in the superotemporal quadrant of the retina in which progressive retinal atrophy circumscribed to this lesion was observed. The mean total thickness of the right eyes was 192.3 ± 3.8 µm while the thickness of the outer retina was 104.7 ± 3.9 µm. At 30 days after FFL, the total retinal thickness decreased to 102.8 ± 17.2 µm and the outer retinal thickness decreased to 10.2 ± 5.7 µm Analysis of the survival of S-cone outer segments (SES+) in the lesion area in the adult albino rat retina showed a total number of SES+ of 2398 ± 388. At day FFL, the number of SES+ in the ACC decreased significantly to 1369 ± 364. At 3 days the SES+ number was maintained and then decreased progressively until 14 days FFL, when the number of SES+ declined by 85% in leison area and remained constant until 30 days FFL. After FFL, the appearance of Iba-1+ cells circumscribed to the center of the lesioned area was observed at 24 hours after FFL and was maintained until 30 days after FFL. The morphology of these cells changed at different study intervals. The study of the quantification and distribution of arrestin+ cones (SEa+) in the pigmented mouse retina showed that the total number of SEa+ was 141,842 ± 11,288. These showed an increasing dorso-ventral gradient and high density in the central retina versus the periphery. The number of L (SEL+) and S (SES+) cones was lower (131,172 ± 8,945 and 111,158 ± 9,805). The study of retinal cross-sections showed that 99% of L cones also expressed arrestin, while 92% of arrestin+ cones also expressed S opsin. The "in vivo" study by SD-OCT after FFL in the pigmented mouse retina showed a lesion in the superior temporal quadrant of the retina. The mean total retinal thickness of the pigmented mouse retina in control right eyes was 205.05 ± 4.2 µm (n=6), while the mean outer retinal thickness was 116.5 ± 2.88 µm. In the lesion area, progressive total retinal atrophy was observed until 5 days FFL, when the mean total retinal thickness was 127.15 ± 4.47 µm and remained constant until 7 days FFL. Ex vivo analysis of arrestin+ cone degeneration in the lesion area after FFL showed a circular lesion in the superior temporal quadrant whose distance to the optic nerve was approximately 1 mm. The number of SEa+ of control right eyes in the lesion area was 6218 ± 341. Analysis of SEa+ degeneration in the lesion area revealed a progressive degeneration of SEa+ that was significant at 3 days after FFL (5516 ± 183) and continued until 7 days after FFL when the number of SEa+ was 3966 ± 311. The in vivo study of retinal thickness in the lesion area after FFL and administration of bFGF and minocycline alone or in combination showed that those retinas treated with bFGF alone or in combination had a slowing of retinal atrophy, at the expense of the outer layers, at 5 days after FFL relative to vehicle-treated retinas). This effect disappeared 7 days after FFL. Immunofluorescence study of the survival of arrestin+ cones in retinas treated with bFGF and minocycline alone or in combination revealed a neuroprotective effect on the number of SEa+ in the bFGF- and bFGF+minocycline-treated group at 7 days after FFL versus their vehicles. In the lesion area microglia located in the outer plexiform layer (EPC) revealed that those retinas treated with intravitreal therapies had 22-40% more microglia cells in the lesion area than those treated with intraperitoneal therapies or control right retinas. However, retinas treated with bFGF+minocycline had a lower number of microglia cells in the SPC at 7 days after FFL. Qualitative analysis of Iba-1+ cells in the photoreceptor outer segment layer (PES) located in the lesion area after FFL revealed that in control right retinas the presence of these cells is anecdotal. However, after FFL we observed the appearance of Iba-1+ cells in the lesion area whose morphology was different at 3 days after FFL, presenting a more rounded or amoeboid morphotype than at 7 days after FFL when the morphology was more elongated. In retinas treated with minocycline the presence of these cells in the SEF layer was lower than in those treated with other therapies. The study of the RPE showed that after FFL there is a progressive degeneration of the RPE cells, with a decrease in the number of cells contained in the lesion area and alterations in their morphology. The right control epithelia showed a number of RPE cells in the 10,000 µm2 study area of 24.3 ± 3 cells with a mean cell area of 353.4 ± 124.4 µm2 (n=6). At 7 days, the EPR cell number declined by about 47% and there was an increase in the mean cell area of the EPRs. At 3 days after FFL, retinas treated with bFGF and bFGF+minocycline preserved the mean cell area, However, bFGF and bFGF+minocycline therapies did not produce significant differences in the number of RPE cells at 3 and 7 days after FFL.